Identificazione di splicing alternativo e poliadenilazione in dati di RNA-seq
24 giugno 2021
Lo splicing alternativo (AS) e la poliadenilazione alternativa (APA) espandono la diversità delle isoforme di trascrizione e dei loro prodotti. Qui, descriviamo i protocolli bioinformatici per analizzare i saggi di sequenziamento di massa dell'RNA-seq e 3' per rilevare e visualizzare AS e APA che variano in base alle condizioni sperimentali.
Questo protocollo fornisce una comprensione completa delle isoforme geniche generate dallo splicing alternativo e dalla poliadenilazione fornendo un flusso di lavoro passo-passo per identificare i siti di splicing differenziale, gli esoni differenzialmente espressi e i siti poli(A). Il vantaggio principale di questo protocollo è che valuta sia i metodi basati sugli esoni che quelli basati sugli eventi per lo studio dello splicing alternativo. Applica anche il metodo basato sull'esone per studiare la poliadenilazione alternativa.
Sono stati forniti i file R Markdown che includono i codici e le note per l'analisi AS e AP. Sarebbe consigliabile seguire i passaggi nel file R Markdown e raggiungere attentamente la nota per ogni passaggio. Per identificare lo splicing differenziale usando diffSplice da limma, seguire il file R notebook.
Preparare i file di input come descritto nel testo manuscritto. Assicurati che i passaggi da uno a tre del manoscritto siano stati seguiti in sequenza per preparare i file di input prima di procedere ulteriormente. Inizia caricando le librerie necessarie.
Per eseguire il filtraggio non specifico, estrarre innanzitutto la matrice dei conteggi di lettura ottenuti in precedenza e creare un elenco di funzionalità utilizzando la funzione DGEList dal pacchetto edgeR, dove le righe rappresentano i geni e le colonne rappresentano i campioni. Quindi, trasforma i dati da scala grezza a conteggi per milione usando la funzione CPM dal pacchetto edgeR e mantieni gli esoni con conteggi superiori a una soglia impostabile. Questo set di dati contiene sei esempi.
Pertanto, il CPM è fissato a più di uno e almeno tre campioni su sei. Normalizzare i conteggi tra i campioni con la funzione calcNormFactors dal pacchetto edgeR utilizzando i valori Trimmed Mean of M. Questa funzione calcolerà i fattori di ridimensionamento per regolare le dimensioni della libreria.
Utilizzare la tabella di esempio generata in precedenza per creare la matrice di progettazione per definire le condizioni sperimentali per ogni campione. Eseguire la funzione voom del pacchetto limma per elaborare i dati di sequenziamento dell'RNA per stimare la varianza. Questa funzione genererà pesi di precisione per correggere il rumore del conteggio di Poisson e trasformare i conteggi del livello di esone in registrare due conteggi per milione o logCPM.
Eseguire la funzione lmfit per adattare i modelli lineari ai dati di espressione per ogni esone. Quindi eseguire la funzione eBayes per calcolare statistiche empiriche per il modello adattato per rilevare l'espressione differenziale dell'esone. Definire una matrice di contrasto per i confronti sperimentali di interesse.
Usa i contrasti. Funzione fit per ottenere coefficienti ed errori standard per ogni coppia di confronti. Eseguire diffSplice sul modello adattato per testare le differenze nell'uso dell'esone dei geni tra wild type e knockout.
Esplora i risultati migliori usando la funzione topSplice dove un test uguale a t fornisce una classificazione degli esoni AS e il test uguale a simes fornisce una classificazione dei geni. Eseguire la funzione plotSplice per tracciare i risultati. Nel mettere il gene di interesse nell'argomento dell'ID genico, i punti rossi mostrano gli esoni differenzialmente espressi.
Genera un grafico vulcanico utilizzando il pacchetto di bioconduttori EnhancedVolcano per mostrare gli esoni espressi in modo differenziale. Per utilizzare rMATS, assicurarsi che la versione più recente di rMATS versione 4.1.1 sia installata utilizzando conda o GitHub nella directory di lavoro. Passare alla cartella contenente i file bam ottenuti dopo la mappatura.
Preparare i file di testo come richiesto da rMATS per le due condizioni di copia del nome dei file bam e del loro percorso separati da una virgola. Eseguire rmas. py utilizzando i due file di testo di input generati che descrivono il percorso dei file BAM e l'annotazione.
GTF ottenuto in precedenza. In questo modo viene generata una cartella di output contenente rmats_out file di testo che descrivono separatamente le statistiche, inclusi i valori P e i livelli di inclusione per ciascun evento di giunzione. Utilizzare il maser del pacchetto bioconduttore per esplorare i risultati di rMATS.
Caricare i file di testo con estensione JCEC nell'oggetto maser e includere almeno cinque letture medie per evento di giunzione per filtrare il risultato in base alla copertura. Per visualizzare i risultati di rMATS, eseguire innanzitutto la funzione topEvents dal pacchetto maser, selezionando gli eventi di giunzione significativi con una frequenza di falsa individuazione del 10% e una variazione minima del 10% della percentuale di giunzione in o PSI. Controllare gli eventi genetici per i singoli geni di interesse e tracciare i valori PSI per ogni evento di splicing di quel gene.
Generare un grafico a vulcano specificando il tipo di evento. Utilizzare i risultati degli eventi di giunzione ottenuti con rMATS sotto forma di file di testo per generare grafici di sashimi utilizzando il pacchetto rmats2sashimiplot. Il grafico del sashimi mostra un evento di esone saltato nel gene Wnk1.
Ogni riga rappresenta un campione di RNA-seq, tre repliche di wild type e Mbnl1 knockout. L'altezza mostra la copertura di lettura in RPKM e gli archi di collegamento raffigurano le letture di giunzione attraverso gli esoni. La parte inferiore mostra isoforme alternative annotate del modello genetico.
Un sostanziale cambiamento di piega e una forte evidenza statistica di differenze reali possono essere osservati nei geni situati nei quadranti in alto a sinistra o a destra dei grafici vulcanici ottenuti utilizzando diffSplice e DEXSeq. Si è scoperto che un esone a cassetta varia tra le diverse condizioni per il gene Wnk1. Il grafico di utilizzo differenziale dell'esone ha mostrato prove di splicing differenziale in cinque siti di esoni vicino a Wnk1.6.45, con gli esoni evidenziati in rosa che probabilmente saranno giuntati nei campioni knockout Mbnl1 rispetto al wild type.
La trama vulcanica di geni che sono alternativamente giuntati ha aiutato a distinguere tra i geni che sono stati esclusi dal wild type e quelli che sono stati inclusi nel wild type. I tipi di eventi di splicing SE, A5SS, A3SS, MXE e RI sono stati visualizzati utilizzando grafici di sashimi dei principali geni significativi di tali eventi. L'attività differenziale dell'APA in tre regioni primarie non tradotte di geni è stata osservata utilizzando grafici vulcanici.
I risultati di utilizzo del sito PA significativamente differenziati acquisiti da diverse pipeline sono stati visualizzati utilizzando il grafico degli eventi. Un significativo spostamento da distale a prossimale dell'uso del sito PA in doppi knockout può essere osservato in entrambi i geni FOSL1 e Papola. La copertura media nelle regioni fiancheggianti ancorate a siti di scissione PA noti a livello dell'intero genoma è stata determinata utilizzando un grafico diagnostico.
Assicurarsi che i parametri come le informazioni transspecifiche e consentire la sovrapposizione multipla siano utilizzati correttamente durante la generazione delle metriche di conteggio. L'adattamento del modello lineare e la generazione di coppie di contrasto è importante per un corretto confronto. Per rMATS, assicurarsi che tutti i parametri siano impostati correttamente in base ai dati prima di eseguire il comando.
I geni ottenuti dall'attività di splicing differenziale potrebbero essere utilizzati per eseguire analisi di arricchimento del set genico. Un altro strumento chiamato MISO potrebbe essere utilizzato per ulteriori analisi basate sugli eventi.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio affronta la complessità dello splicing alternativo (AS) e della poliadenilazione alternativa (APA) nella regolazione dell'espressione genica. Utilizzando protocolli bioinformatici per analizzare i dati di sequenziamento dell'RNA, la ricerca evidenzia i vantaggi di metodi basati sull'esone e basati sugli eventi per rilevare e visualizzare lo splicing alternativo e la poliadenilazione in diverse condizioni sperimentali.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Splicing alternativo
- Poliadenilazione alternativa
- Bioinformatica
Contesto
- Aumento della diversità delle isoforme trascritte
- Impatto sull'espressione genica
- Avanzamenti tecnologici nel sequenziamento dell'RNA
Metodi utilizzati
- Protocolli bioinformatici per l'analisi dell'RNA-seq
- Metodi di rilevamento basati sull'esone e basati sugli eventi
- Visualizzazione dei siti di splicing e degli eventi di poliadenilazione
Risultati principali
- Identificazione di siti di splicing differenziale e uso dei siti poli(A)
- Evidenza di splicing alternativo e poliadenilazione in varie condizioni sperimentali
- Visualizzazione di successo dei risultati attraverso grafici e output bioinformatici
Conclusioni
- I risultati dimostrano una significativa variabilità in AS e APA in diverse condizioni.
- Questo lavoro contribuisce alla nostra comprensione della diversità dei trascritt e delle sue implicazioni per la ricerca biologica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Alternative splicing and polyadenylation analysis enables biopharma R&D teams to resolve isoform-specific regulatory mechanisms that are obscured at the gene-expression level. This mechanistic de-risking supports target validation by clarifying functional consequences of genetic perturbations and improving predictive confidence in lead identification. Integrating exon- and event-based RNA-seq workflows enhances assay readiness for downstream screening and translational biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by identifying differential exon usage and polyadenylation site shifts that reflect isoform-specific gene regulation.
- Operational Value: Apply exon-based methods to study alternative polyadenylation, enabling unified analysis of splicing and 3' end processing from a single RNA-seq dataset.
- Predictive Value: Detect cassette exon variations and distal-to-proximal polyadenylation shifts that inform functional target de-risking and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generate quantitative exon-level and splicing-event readouts (e.g., percent spliced in, inclusion levels) suitable for high-resolution compound screening.
- Operational Value: Normalize and filter count data using edgeR and limma workflows to ensure reproducibility across replicates and conditions.
- Assay Readiness: Produce visualization-ready outputs such as volcano plots, sashimi plots, and event plots for cross-functional review of splicing and polyadenylation dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Link differential splicing and polyadenylation events to disease-relevant genes (e.g., Wnk1, FOSL1) observed in knockout models, supporting mechanistic continuity.
- Operational Value: Use rMATS and maser packages to filter significant splicing events by false discovery rate and percent spliced-in change, enabling robust biomarker candidate selection.
- Translational Value: Visualize isoform-specific expression changes via sashimi plots to support preclinical validation of target engagement and mechanism of action.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing isoform-resolution data that informs target validation, assay development, and mechanistic follow-up in lead optimization.
- Discovery Biology: Test hypotheses about isoform regulation by comparing exon usage and polyadenylation site distribution across genetic or pharmacological conditions.
- Screening: Generate standardized, quantitative exon and splicing event metrics that support reliable compound effect assessment in phenotypic or target-based assays.
- Analytics: Derive empirical statistics, p-values, and effect sizes from linear modeling (voom, lmfit, eBayes) and event-based tools (rMATS, diffSplice) to compare conditions objectively.
- Translational Research: Connect splicing and polyadenylation changes to gene-level phenotypes in preclinical models, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Deploy the R Markdown-based protocol as a reusable bioinformatics capability across projects studying genetic models, drug treatments, or disease tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduce mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific regulatory layers missed in conventional gene-level differential expression analysis.
- Operational Value: Ensure reproducibility through standardized normalization (CPM, calcNormFactors), filtering thresholds, and validated Bioconductor packages (limma, edgeR, rMATS, maser).
- Strategic Value: Improve go/no-go decisions by providing early evidence of isoform-level target modulation, reducing late-stage biological attrition risk.
- Portfolio Impact: Enable risk-adjusted prioritization of targets based on concordant splicing and polyadenylation evidence across orthogonal methods (exon-based and event-based).
Implementation Considerations
- Requires bioinformatics expertise in RNA-seq analysis, linear modeling, and splicing event interpretation using R/Bioconductor.
- Dependent on aligned BAM files, gene annotation (GTF), and count matrices generated from standard RNA-seq preprocessing.
- Necessitates cross-team standardization of filtering criteria (e.g., CPM >1 in ≥3 samples) and statistical thresholds (FDR <0.1, ΔPSI ≥10%) for reproducible results.
- Involves adaptation of parameters (e.g., overlap settings, transpecific information) when applying count metrics to alternative splicing and polyadenylation pipelines.
- Includes practical limitations such as the need for sufficient sequencing depth to detect low-abundance isoforms and the importance of validating computational predictions with orthogonal methods (e.g., PCR, long-read sequencing).
