Rapida fissazione in vivo e isolamento dei complessi traslazionali dalle cellule eucariotiche

Il flusso di lavoro consiste nella crescita di cellule in condizioni ambientali rigorosamente controllate, raffreddandole rapidamente utilizzando acqua di fusione / ghiaccio e fissandole con concentrazione pre-ottimizzata di formaldeide e tempo di incubazione. La reazione di fissazione viene quindi estinta utilizzando l'eccesso di composti contenenti gruppi amminici primari, come glicina o tripsi. Le cellule vengono raccolte, lavate e possono essere conservate congelate.

Le cellule fisse possono essere lisate meccanicamente o chimicamente e il lisato viene utilizzato per la separazione delle frazioni ribosomiali in base alle loro dimensioni molecolari, proprietà di sedimentazione o marcatori di affinità. L'approccio si traduce in materiale versatile utilizzabile per la purificazione e il rilevamento immunoassistituzione, l'arricchimento di complessi contenenti fattori specifici in microscopia elettronica. Dopo il blocco profondo reticolato, l'amplificazione dell'RNA o le analisi basate sull'ibridazione, il sequenziamento dell'RNA e la spettrometria di massa diventano possibili.

Impostare una coltura di lievito da un litro in uno shaker orbitale con una densità ottica iniziale non superiore a 0,05 unità di assorbanza a 600 nanometri e utilizzare peptone e destrosio a 30 gradi Celsius. Impostare una centrifuga preparativa con rotore compatibile e bottiglie centrifughe per pellettizzare la sospensione liquida di cellule di lievito a 5000 G a quattro gradi Celsius. Tenere traccia della densità ottica delle cellule in crescita.

Deve essere compreso tra 0,6 e 0,8 unità di assorbanza e 600 nanometri al momento della raccolta se la fase di crescita esponenziale è di interesse. Una volta che le celle sono pronte, installa una ghiacciaia all'interno della cappa dei fumi chimici con un fornaio contenente 250 grammi di ghiaccio d'acqua tritato pulito e mostra anche 25 millilitri di tripsina e soluzione di metanolo stabilizzato al 37% di formaldeide all'interno della cappa. Versare l'ultima coltura cellulare nel fornaio contenente il ghiaccio.

Quindi aggiungere 75 millilitri di formaldeide al 37% a una concentrazione finale del 2,2% di peso sul volume mescolare intensamente la miscela fino a quando il ghiaccio si scioglie. Una volta sciolto il ghiaccio, impostare un timer per 10 minuti Dopo l'incubazione per 10 minuti, trasferire la coltura nelle bottiglie della centrifuga pre-raffreddate e pellettizzare le celle mediante centrifugazione a quattro gradi Celsius, 5000 G per cinque minuti. Mentre lo spin è, pre-raffreddare un tubo da 50 millilitri e mantenere il tampone A appena preparato contenente glicina per neutralizzare l'eventuale formaldeide rimanente sul ghiaccio.

Dopo la centrifugazione, posizionare i tubi della centrifuga sul ghiaccio con il lato pellet a contatto con il ghiaccio. Portare i tubi nella cappa aspirante e gettare il surnatante in un contenitore per rifiuti di formaldeide. Sospendere nuovamente il pellet di cella da vecchi tubi in 20 millilitri di tampone A utilizzando una stripette da 25 millilitri e trasferendolo in un tubo da 50 millilitri.

Portare il volume a 40 millilitri con tampone A e raccogliere le celle di lavaggio mediante centrifugazione di quattro gradi Celsius, 5000 G per cinque minuti. Scartare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in un tampone da 40 millilitri A, che è il tampone A non contenente glicina per rimuovere la contaminazione da glicina. Pellet le celle di nuovo per centrifugazione a quattro gradi Celsius, 5000 G cinque minuti.

Ripetere i lavaggi con buffer A uno, ancora una volta. Scartare il surnatante e posizionare il pellet cellulare sul ghiaccio. Pesare il tubo con il pellet, la massa delle cellule umide dovrebbe essere di circa un grammo per un litro della coltura cellulare.

Riempire il polistirolo dalla scatola rivestita con un foglio di alluminio con azoto liquido ad una profondità di circa tre centimetri. Posizionare a 50 millilitri tubo in posizione verticale nella scatola. Sospendere nuovamente il pellet in 550 microlitri di tampone A due mediante pipettaggio e vortice per 10 secondi.

Aggiungere 10 microlitri di 40 unità per microlitro inibitore della RNasi e vortice di nuovo per 10 secondi. Utilizzando una pipetta da un millilitro, gocciolare la sospensione cellulare nei due 50 millilitri contenenti l'azoto liquido. Per prepararsi al passo successivo, pre-raffreddare tubi liberi da nucleo da 1,5 millilitri su ghiaccio secco e barattoli di macinazione in acciaio inossidabile da 10 millilitri.

Trasferire le goccioline di sospensione cellulare congelate nei barattoli utilizzando una spatola sterile pulita. Immergere i barattoli di macinazione in azoto liquido per un minuto, assicurandosi che la fase liquida rimanga sopra la giunzione. Installare un mulino di miscelazione Cryo a 27 Hertz per l'agitazione per un minuto.

Agitare i barattoli di macinazione sigillati a 27 Hertz per un minuto nel mulino miscelatore. Raffreddare nuovamente i barattoli in azoto liquido come prima e agitare ulteriormente per un minuto. Trasferire i barattoli nella ghiacciaia contenente ghiaccio secco insieme ai tubi liberi dal nucleo da 1,5 millilitri.

Utilizzando una piccola spatola in acciaio trasferire i risultati in data di macinazione imbottita nei tubi. Quindi conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius. In due palloni T175 crescono 293 cellule HEK al 60-70% di confluenza e il mezzo Eagle modificato di Dalbeko e il siero bovino fetale al 10% a 37 gradi e il 5% di anidride carbonica.

Almeno tre ore prima del tempo di fissaggio desiderato, sostituire il supporto del pallone T175 con esattamente 30 millilitri di supporti completi preriscaldati. Preparare una ghiacciaia fino all'orlo con ghiaccio d'acqua frantumato e tenere nella cappa aspirante insieme ai buffer richiesti, anche un ghiaccio. Per raffreddare a scatto le celle, rimuovere il pallone T175 dall'incubatore e premerlo formalmente contro il ghiaccio assicurando il massimo contatto superficiale.

All'interno di una cappa chimica, inclinare il pallone su un lato in modo che il supporto si raccolga sul lato opposto alle celle. Pipetta 168 microlitri del 37% pesati in volume formaldeide direttamente nel mezzo in pool. Dando una concentrazione finale di 0,2% di formaldeide.

Mescolare immediatamente. Incubare i palloni su ghiaccio per altri 10 minuti. Versare il supporto in un contenitore di rifiuti appropriato attraverso il lato del pallone opposto alle celle.

Usando uno strippete, pipetta in 30 millilitri di fosfato di Dalbeko tamponato soluzione salina senza ioni calcio e magnesio e contenente inoltre 50 millimolari glicina delicatamente sul lato opposto alle cellule. Mescolare dondolando il pallone, riportare il flash in posizione orizzontale e incubare per altri 10 minuti sul ghiaccio. Versare la soluzione attraverso il lato del matraccio opposto alla cella e aggiungere delicatamente sette millilitri di soluzione standard di TRIPSINA EDTA allo 0,25% per staccare e sospendere nuovamente le cellule.

Incubare il pallone a temperatura ambiente per cinque, al massimo 10 minuti. Posizionare il pallone verticalmente e utilizzando uno strippete, raccogliere le celle staccate lavando delicatamente eventuali residui dalle pareti del pallone e trasferire la sospensione in un tubo da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Integrare immediatamente la soluzione di sospensione raccolta con 20 millilitri di materiale completo e mescolare capovolgendo delicatamente il tubo.

Pellet le celle centrifugando il tubo a 100 G per cinque minuti e quattro gradi Celsius. Il pellet cellulare deve essere chiaramente visibile. Versare il fluido e sospendere delicatamente il pellet in 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato di Dalbeko senza glicina.

Centrifugare nuovamente il tubo a 100 G per cinque minuti e a quattro gradi Celsius Versare il tampone di lavaggio e risospendere il pellet in 800 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato di Dalbeko ghiacciato senza glicina, ma contenente ioni magnesio e calcio. Trasferire le cellule ri-sospese in un nuovo tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri a basso legame proteico. Centrifugare il tubo a 100 G per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Scartare con attenzione il surnatante usando un pipetter da un millilitro. In questa fase, il pellet cellulare può essere congelato a meno 80 gradi Celsius o procedere alla fase di lisi cellulare. In un armadio di biosicurezza aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi a base di detergente non ionico e non denaturante e sette microlitri di inibitore dell'arginasi e mescolare bene mediante pipettaggio con una punta di millilitro.

Fissare con attenzione un ago calibro 25 a una siringa da uno a tre millilitri e pipettare vigorosamente la miscela utilizzando almeno sette prese lente verso l'alto e corse di scarico veloci verso il basso. Gettare la siringa e l'ago nel cestino del tagliente e ripetere la procedura con un ago calibro 31 e una siringa da 0,3 millilitri. Gettare la siringa e l'ago nel cestino del tagliente.

Centrifugare il tubo a 12.000 G per cinque minuti a quattro gradi per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri a basso legame proteico. Conservare sia i detriti cellulari che il lisato a meno 80 gradi Celsius.

I complessi traslazionali sono sensibili alla composizione ionica dei buffer. L'omissione di cloruro di magnesio e l'aggiunta di EDTA hanno abrogato elevate proprietà di sedimentazione e, mentre il cloruro di calcio ha portato a picchi di risultati migliori, il miglioramento è stato marginale. Abbiamo quindi selezionato il buffer uno.

Il 2,2% peso per volume di formaldeide ha preservato in modo eccellente i polisomi e non ha diminuito la resa complessiva rispetto al 4% peso per volume di formaldeide. Nelle cellule di mammifero è stata utilizzata una concentrazione molto più bassa di formaldeide dello 0,2% in peso in volume. Poiché concentrazioni più elevate hanno comportato una sostanziale perdita di materiale poliribosomico.

15 EDTA millimolari aggiunti al lisato e tutti i tamponi successivi hanno mostrato un effetto destabilizzante nettamente minore sulle frazioni polisomiali, derivate dalle cellule fisse. E questo effetto è stato parzialmente replicato con EDTA 50 millimolari con materiale da celle fisse al 4%, resistendo, dispiegandosi meglio. L'esaurimento del glucosio provoca uno degli effetti inibitori traslazionali più drammatici e rapidi sul lievito.

Sia il nervo aggiunto che le condizioni di causa locale indotte lo smontaggio del polisoma era leggermente, ma evidentemente più polisomi trattenuti in basso glucosio aggiunto. È importante sottolineare che il materiale polisomiale delle cellule fisse dimostra un'elevata distinzione tra le cellule affamate e non affamate, indicando l'idoneità della fissazione della formaldeide a preservare le differenze nei processi traslazionali dinamici. In approcci come il tacy paysake, può essere ulteriormente perspicace rimuovere piccole subunità ribosomiali che non si integrano bene con i rizomi completi per i quali abbiamo impiegato un'ultracentrifugazione a due stadi, consentendo l'isolamento di SSU, LSU, RS, diazomi resistenti alla RNasi, DS e polisomi di alto ordine confermati dalla microscopia elettronica delle frazioni fisse.

Rispetto alle cellule non fisse, il materiale delle cellule fisse ha dimostrato un'elevata presenza di eIF4A labile nelle frazioni ribosomiali a sedimentazione più rapida. Utilizzando materiale fisso dal ceppo di tapi eIF4A per catturare e arricchire eIF4A contenente complessi con perline IDG magnetiche, siamo stati in grado di osservare l'arricchimento selettivo dell'eIF4A rispetto alla beta-actina in SSU e RS, ma non le frazioni LSU dal secondo gradiente dopo RNasi uno smontaggio. Rispetto ad altri metodi di riposo traslazionale, la rapidità dell'azione della formaldeide attraverso le membrane cellulari e la natura indiscriminata dei legami incrociati promettono la conservazione della massima diversità degli intermedi complessi di traduzione.

I nostri risultati conformano l'usabilità della rapida fissazione della formaldeide per stabilizzare complessi altamente transitori e dimostrano l'utilità negli scenari di risposte cellulari rapide ai cambiamenti ambientali o alle condizioni di stress.