Name: Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2-deossiuridina/fosfo-istone H3 per lanalisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Impara il protocollo di doppia marcatura EdU/pH3 per analizzare le fasi del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali di Drosophila. Questo metodo consente di distinguere le cellule in fase G1, S e M con microscopia a fluorescenza.

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Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (sovvenzione del progetto 31003A_173188; www.snf.ch) e dell'Università di Berna (www.unibe.ch) a BS. I finanziatori non avevano alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

1. Preparazione dei reagenti e delle scorte per il test Click-it EdU
NOTA: fare riferimento alla Tabella dei materiali e alla Tabella 1 per i dettagli sul kit e sui reagenti forniti con il kit.
<ol><li>Portare i flaconcini a temperatura ambiente prima di preparare le soluzioni.</li>
	<li>Preparare 10 mM di soluzione madre EdU (componente A) aggiungendo 2 mL di dimetilsolfossido (DMSO, componente C). Mescolare bene e conservare a -20 °C.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro di Alexa Fluor 647-azide (componente B) aggiungendo 70μL di DMSO (componente C). Mescolare bene e conservare a -20 °C.</li>
	<li>Preparare una soluzione 1x di tampone di reazione Click-iT EdU (componente D) mescolando 4 mL di questa soluzione con 36 mL di acqua deionizzata. Conservare la soluzione rimanente a 2-6 °C.</li>
	<li>Fare un 10x stock (200 mg/mL) dell'additivo tampone Click-iT EdU (componente F) aggiungendo 2 mL di acqua deionizzata. Mescolare bene e conservare a -20 °C.</li>
	<li>Conservare Hoechst 33342 (componente G) a 2-6 °C. Conservare DMSO (componente C) in un essiccatore a -20 °C. NOTA: i guanti devono essere utilizzati per maneggiare DMSO e Hoechst.</li>
</ol>2. Dissezione del cervello larvale del terzo instar e incorporazione di EdU
NOTA: Il protocollo per le dissezioni cerebrali è stato descritto in precedenza12. Prima di iniziare le dissezioni, assicurarsi che quantità sufficienti di soluzioni edU e PFA siano preparate e scongelate come descritto ai punti 2.6 e 3.1.
<ol><li>Preparare 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) aggiungendo 25,6 g na2HPO4,7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl e 2 g KH2PO4 a 1 L di acqua deionizzata. Regolare il pH a 7,4 e successivamente preparare una soluzione 1x in acqua deionizzata.</li>
	<li>Aggiungere il mezzo di dissezione (SM) di Schneider a due depressioni consecutive di una lastra di vetro (3 o 9) di vetro. Aggiungi 1x PBS alla successiva depressione consecutiva.</li>
	<li>Usando un paio di pinze, scegli le larve di terza stella vaganti e posizionale su un tessuto bagnato con PBS per pulire i residui di cibo della mosca. Posizionare la larva nella depressione con PBS e poi nella depressione consecutiva con SM.</li>
	<li>Usando un paio di pinze fini, rimuovere3/4 della parte inferiore del corpo della larva.<ol>
<li>Afferrare delicatamente i ganci della bocca larvale con un paio di pinze e tenere la cuticola all'altra estremità con l'altra coppia di pinze.</li>
		<li>Ruotare la testa larvale dall'interno verso l'esterno spingendo verso l'interno i ganci della bocca e contemporaneamente staccando il tessuto all'altra estremità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Osserva il cervello larvale con dischi immaginali attaccati. Rimuovere altri tessuti attaccati al cervello e trasferire il cervello alla successiva depressione consecutiva con SM.</li>
	<li>Scongelare la soluzione stock EdU da 10 mM. Preparare una soluzione da 100 μM diluendo questo stock da 10 mM in SM.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di questa soluzione EdU+SM da 100 μM in un'altra depressione sulla piastra Pyrex. Incubare ~5-10 cervelli sezionati in 100 μL di soluzione EdU+SM da 100 μM per 2 ore a 25 °C. NOTA: poiché i NB si dividono una volta in ~ 2 h, questo protocollo mira ad analizzare un ciclo cellulare completo. Usa solo cervelli intatti per ulteriori passaggi. Scartare i cervelli danneggiati durante la dissezione.</li>
</ol>3. Fissazione e immunocolorazione
<ol><li>Preparare la soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) in una cappa aspirante.<ol>
<li>Aggiungere 4 g di polvere di paraformaldeide a 80 mL di 1x PBS in un becher posto su un agitatore magnetico e riscaldare a 60 °C. Per sciogliere il PFA, aggiungere alcune gocce di 1 N NaOH. Controllare il pH e regolare a 7,0 con alcune gocce di 1 M HCl, se necessario.</li>
		<li>Regolare il volume a 100 ml con 1x PBS. Aliquotare la soluzione di PFA e conservare a 2-6 °C per un massimo di 1 mese. Aggiungere lo 0,3% di detergente non ionico (vedere la Tabella dei materiali)alla soluzione di PFA per una fissazione efficiente di tessuti di grandi dimensioni come il cervello larvale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'incorporazione di EdU, trasferire il cervello in tubi microcentrifuga da 0,6 ml contenenti il 4% di PFA. Incubare a temperatura ambiente su un nutator per 15 min. Toccare il tubo sul banco di laboratorio in modo che il cervello si stabilizzi nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Rimuovere il PFA e lavare 3 volte con PBS + 0,3% detergente non ionico (PBST) a temperatura ambiente. Assicurarsi che ogni lavaggio duri almeno 10 minuti su un nutatore. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere PBST, aggiungere la soluzione bloccante (PBST + 5% di albumina sierica bovina) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Anticorpo anti-Miranda diluito (1:250) e anticorpo anti pH3 (1:200) in PBST (entrambi gli anticorpi nello stesso tubo). Rimuovere il tampone di blocco e aggiungere la soluzione anticorpale primaria. Incubare durante la notte a 2-6 °C su un nutatore. NOTA: Miranda è una proteina di membrana presente sui CB NB. Serve a identificare queste grandi cellule rotonde nella regione CB13.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare 3 volte con PBST. Assicurarsi che ogni lavaggio duri 10 minuti su un nutatore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione anticorpale secondaria aggiungendo 1:500 Alexa Fluor 488 anti-Rabbit diluito e Alexa Fluor 568 anti-Rat in PBST. Rimuovere il PBST e aggiungere la soluzione anticorpale secondaria al cervello sezionato. Incubare durante la notte a 2-6 °C al buio, su un nutatore, e lavare 3 volte con PBST (passaggio 3.5).</li>
</ol>4. Rilevamento EdU, colorazione del DNA e montaggio
<ol><li>Per preparare il cocktail di rilevamento EdU, mescolare i componenti (vedere Tabella 2) in un tubo da 1,5 ml.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio (passaggio 3.6), rimuovere PBST e aggiungere il cocktail di rilevamento EdU al cervello sezionato. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti su un nutator. Lavare 2 volte con PBST per 10 minuti ciascuno, al buio.</li>
	<li>Per la colorazione del DNA, diluire Hoechst 33342 (componente G) 1:2.000 in PBST per preparare una soluzione da 5 μg/mL.</li>
	<li>Rimuovere PBST dopo il secondo lavaggio (fase 4.2) e aggiungere 500 μL di 5 μg/mL di soluzione di Hoechst al cervello sezionato. Incubare al buio per 10 minuti. Rimuovere Hoechst e lavare una volta con PBST per 10 minuti.</li>
	<li>Tocca il tubo sul banco di laboratorio e lascia che il cervello si stabilizzi. Rimuovere il PBST dal tubo, ma lasciare solo 50-100 μL.</li>
	<li>Tagliare l'estremità di una punta di micropipetta da 200 μL e trasferire con cura il cervello su un vetrino pulito. Rimuovere il PBST in eccesso dalla diapositiva tamponando con strisce di carta da filtro. Fai attenzione a non lasciare che la carta da filtro tocchi il cervello.</li>
	<li>Metti una goccia di mezzo di montaggio solubile in acqua e non fluorescente sul cervello e orienta il cervello in modo tale che il cordone nervoso ventrale sia rivolto verso lo scivolo e i lobi rivolti verso l'alto. Disporre i cervelli in un unico file in modo che sia più facile visualizzare il cervello in serie.</li>
	<li>Posiziona delicatamente una copertina sopra il cervello. Posizionare il vetrino a 2-6 °C durante la notte. NOTA: il supporto di montaggio si indurisce durante la conservazione durante la notte in modo che non sia necessario sigillare il coperchio con lo smalto per unghie.</li>
</ol>5. Imaging
NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sul microscopio a scansione laser e sull'obiettivo ad immersione in olio utilizzati in questo protocollo.
<ol><li>Dal software di acquisizione, selezionare l'obiettivo 63x.</li>
	<li>Metti una goccia di olio per immersione sulla copertina appena sopra il cervello montato per rendere più facile individuare il tessuto attraverso l'oculare.</li>
	<li>Utilizzando il canale DAPI/Hoechst 33342, trovare il cervello attraverso l'oculare, quindi passare alla modalità di acquisizione nel software.</li>
	<li>Imposta 4 canali per visualizzare Le immagini di Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) e Alexa Fluor 647 (EdU). Utilizzare lo strumento dye-assistant, che imposta automaticamente i laser di eccitazione e i filtri di emissione per i coloranti selezionati.</li>
	<li>Imposta il campo visivo in modo tale che comprenda l'intero lobo cerebrale. Immagina l'intero volume del lobo cerebrale acquisendo z-stack distanziati di 0,8 μm l'uno dall'altro. Memorizza tutte le immagini di una sessione di imaging in un formato di libreria *.lif.</li>
</ol>6. Analisi delle immagini
NOTA: i seguenti passaggi descrivono l'analisi delle immagini acquisite e come ordinare le celle in fase G0/G1, fase S, S>G2/M (progressione da S a G2/M) e fase M utilizzando il software ImageJ.
<ol><li>Scarica Fiji (Fiji is ImageJ) dal seguente URL: https://fiji.sc/. Apri Fiji, quindi trascina e rilascia i file .lif in Fiji. NOTA: Fiji è una versione di ImageJ che viene fornita preinstallata con diversi plugin14. Il trasferimento di file .lif nelle Figi aprirà il plug-in Bio-formats, necessario per elaborare i file .lif. Il plug-in Bio-formats è necessario anche per aprire file di immagini generati da altre marche di microscopi, ad esempio file nd2 generati da un microscopio Nikon. Questo plugin viene fornito preinstallato con Fiji.</li>
	<li>Selezionare Browser dati dalla scheda di visualizzazione dello stack e utilizzare lo stack virtuale dalla scheda di gestione della memoria nel plug-in bioformati. NOTA: i file Lif con z-stack da 8-10 cervelli hanno spesso una dimensione di 300-400 megabyte. Sui computer con POCA RAM, l'apertura di alcuni di questi file può esaurire rapidamente la RAM disponibile su ImageJ e impedire qualsiasi ulteriore elaborazione delle immagini. Lo stack virtuale è di "sola lettura", non richiede RAM elevata per l'elaborazione ed è un'opzione ideale per caricare set di dati di grandi dimensioni sulle Figi.</li>
	<li>Osservare l'immagine multicanale visualizzata in ImageJ. Modificare il colore dei canali dalla barra dei menu utilizzando lo strumento Immagine | colore | canali. Osserva i NB etichettati con Miranda come grandi cellule rotonde nella regione CB.</li>
	<li>Disegna una regione di interesse (ROI) utilizzando lo strumento ellisse su ogni NB per evitare di contare l'NB due volte.<ol>
<li>Dalla barra dei menu ImageJ, selezionare analizza | strumenti | ROI manager. Contrassegnare tutti i NB nella sezione z corrente e premere t dopo aver contrassegnato ogni cella.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta che tutti gli NB nella sezione z corrente sono stati contrassegnati, cambiare i canali in pH3 ed EdU e contare manualmente il numero di NB EdU-positivi, NB pH3-positivi, NB che si colorano positivamente sia per EdU che per pH3 e NB non macchiati per entrambi i marcatori.</li>
	<li>Cerca i NB nelle sezioni z successive, elimina i vecchi ROI e aggiungi nuovi ROI per contare i NB in stack diversi.</li>
	<li>Preparare un foglio di calcolo con le seguenti colonne: 1. EdU- pH3-: questa sezione rappresenta le celle a doppio negativo che si trovano nella fase G0/G1 del ciclo cellulare; 2. EdU+: le cellule di questa categoria hanno incorporato EdU e sono in fase di replicazione del DNA (fase S); 3. EdU+ pH3+: queste cellule dual-positive hanno completato la fase S e sono passate alla fase G2 o M; 4. pH3+: questi NB sono sottoposti a mitosi.</li>
	<li>Calcola le percentuali di NB presenti in tutte le 4 categorie precedenti per ciascun lobo. Prepara un grafico a barre utilizzando il software del foglio di calcolo che mostra i dati in pool per le percentuali di NB in ogni categoria.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

L'incorporazione di EdU e la sua successiva reazione "click" con azide permeabile alle cellule presenta vantaggi pratici di questa tecnica rispetto al metodo BrdU utilizzato in precedenza7. Tuttavia, questa reazione è catalizzata dagli ioni Cu(I) e diversi coloranti possono essere instabili in presenza di questo catalizzatore di rame, come è chiaramente consigliato dal produttore del kit Click-it EdU. Quando sono stati eseguiti esperimenti di immunocolorazione dopo aver eseguito la fase di rilevam...

Il ciclo di divisione cellulare comprende una fase G1 (prima fase gap), una fase replicativa/S, una G2 (seconda fase gap) e una fase M (mitotica). Passando attraverso queste fasi, la cellula subisce cambiamenti drammatici nella trascrizione cellulare, nella traduzione e nella riorganizzazione del macchinario citoscheletrico1,2. In risposta a segnali di sviluppo e ambientali, le cellule possono temporaneamente cessare di dividersi e diventare quiescenti (G0) o differenziarsi e cessare permanentemente di dividersi3. Altri scenari, come il danno al DNA, possono causare differenziazione prematura o apoptosi3,4. La risposta a tali segnali è mediata da checkpoint del ciclo cellulare, che fungono da sistema di sorveglianza per garantire l'integrità dei processi cellulari essenziali prima che la cellula si impegni nella fase successiva del ciclo di divisione5. Pertanto, gli studi sui geni che regolano la replicazione del DNA, i checkpoint e i macchinari mitotici devono analizzare possibili difetti di progressione del ciclo cellulare che possono verificarsi nelle cellule mutanti o dopo l'abbattimento del siRNA di questi geni. Inoltre, tali analisi possono essere utilizzate per testare la salute generale delle cellule e le risposte cellulari al trattamento farmacologico.
La 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) è un analogo della timidina che viene incorporato nel DNA durante la replicazione6. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per identificare le cellule in fase S. Tuttavia, le cellule vengono poi sottoposte a dure procedure di denaturazione del DNA per consentire il rilevamento di BrdU attraverso l'uso di anticorpi anti-BrdU6. Questo duro trattamento può danneggiare gli epitopi cellulari e impedire un'ulteriore caratterizzazione del campione attraverso l'immunocolorazione. L'incorporazione di EdU e il successivo rilevamento da parte di una "reazione a clic" catalizzata dal rame con coloranti azide piccoli, permeabili alle cellule e marcati fluorescentemente, elimina la necessità di procedure di denaturazione severe7. Questo metodo, quindi, è emerso come un'alternativa più pratica all'incorporazione di BrdU.
Inoltre, pH3 è stato descritto come un marcatore affidabile per le cellule mitotiche/in fase M8. L'istone H3 è una proteina istonica del nucleo associata al DNA che viene fosforilata intorno alla fase G2 tardiva alla fase M iniziale e viene defosforilata verso la fine dell'anafase8. Diversi anticorpi commerciali possono essere utilizzati per rilevare il pH3 utilizzando protocolli di immunocolorazione standard. La doppia colorazione di EdU e pH3 consentirebbe quindi il rilevamento di cellule in fase S e in fase M. Inoltre, le cellule nella fase G1 e nella fase G2 iniziale non si macchierebbero positivamente per nessuno dei marcatori.
Le cellule staminali neurali o neuroblasti (NB) di Drosophila offrono un modello di cellule staminali ben caratterizzato in cui le cellule si dividono in modo asimmetrico per produrre un NB auto-rinnovante identico e una cellula madre gangliare (GMC), che è destinata alla differenziazione9. Inoltre, diversi strumenti genetici e anticorpi nb-specifici rendono questo sistema adatto per la manipolazione genetica e l'imaging di cellule vive. Di conseguenza, diversi studi hanno utilizzato NB per studiare i geni che regolano le divisioni asimmetriche e la determinazione del destino cellulare9. Popolazioni distinte di NB esistono nel cervello centrale (CB) e nel lobo ottico (OL) del cervello larvale9; Per il presente studio sono stati utilizzati CB NB. Questi CB NB larvali instar sono cellule di grandi dimensioni che sono adatte anche per studiare i fattori che regolano l'assemblaggio del fuso mitotico. Un protocollo per analizzare i difetti di progressione del ciclo cellulare sarebbe uno strumento vitale in tali studi.
I protocolli pubblicati in precedenza impiegavano kit commerciali, come Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, che forniscono diversi componenti di reazione e coloranti azide etichettati con una varietà di coloranti Alexa Fluor per l'incorporazione e il rilevamento di EdU10. Tuttavia, i reagenti forniti con tali kit non sono compatibili con alcuni tag fluorescenti spesso utilizzati con anticorpi secondari. Questo kit di rilevamento EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit fornito con colorante azide coniugato Alexa Fluor 647) è stato testato in Drosophila terzo NB larvale instar e la co-colorazione è stata tentata con anticorpi contro pH3 e Miranda, un marcatore per NB. Inoltre, gli anticorpi secondari alexa Fluor 568 o Cy3 sono stati utilizzati per il rilevamento dell'etichettatura Miranda sulla membrana plasmatica degli NB11. Tuttavia, l'intensità del segnale atteso e il modello di colorazione (risultati non pubblicati) non sono stati osservati con questi anticorpi secondari quando l'immunocolorazione è stata eseguita dopo il rilevamento di EdU.
Per l'incorporazione di EdU, il protocollo descritto da Daul e colleghi richiedeva l'alimentazione delle larve con kankel-white medio mescolato con EdU e bromofenolo blu (BPB)10. Le larve si nutrivano con il cibo a spillo EdU e BPB, che poteva essere visto dal suo colore blu all'ingestione nell'intestino larvale. Sebbene questo metodo sia stato utilizzato per l'incorporazione di EdU nella perdita di funzione di Mms19 (Mms19P) terza larva instar, le larve di Mms19P apparentemente non si sono nutrite poiché quasi nessun colore blu è stato rilevato nell'intestino larvale (risultati non pubblicati). Le larve di Mms19P mostrano drastiche deformità dello sviluppo e alla fine si arrestano nel terzo stadio instar. Ciò può in qualche modo influenzare il comportamento alimentare delle larve della terza stella e rendere il protocollo di alimentazione EdU inadatto a tali casi.
Dopo aver studiato la letteratura disponibile e aver lavorato ampiamente sulla standardizzazione dei passaggi essenziali, è stato proposto un approccio alternativo per la doppia etichettatura EdU/ pH3 nei NB Di Drosophila, che non richiede l'alimentazione di EdU alle larve. Uno studio precedente ha impiegato la doppia colorazione EdU / pH3 per analizzare il ciclo cellulare nei NB, ma non ha presentato un protocollo dettagliato4. Questo rappresenta un ostacolo inutile per i laboratori che cercano di implementare questo metodo. Inoltre, valutare la compatibilità di vari reagenti con il kit EdU ed eseguire un'ulteriore ottimizzazione può essere un processo che richiede molto tempo. Questo documento presenta un protocollo passo-passo che copre l'incorporazione di EdU nel cervello larvale sezionato e l'immunocolorazione con anticorpi anti-pH3, seguita dalla microscopia confocale e dall'analisi delle immagini per assegnare NB a quattro categorie distinte: fase G0 / G1, fase S, S >G2 / M (progressione da S a G2 / M) e fase M. I passaggi che richiedono l'ottimizzazione sono delineati e vengono forniti suggerimenti per l'analisi delle immagini di set di dati di grandi dimensioni. Inoltre, la lettura EdU/pH3 nei NB wild-type viene analizzata e confrontata con i NB P Mms19, che sono stati recentemente segnalati per mostrare un ritardo del ciclo cellulare11.

<table><tbody><tr><td>fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td><td>Bloomington stock center</td><td>#15477</td><td>Inserimento di elementi P nel terzo esone di Mms19</td></tr><tr><td>&nbsp;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td><td>Proteina</td> Mms19 generata in casa <td></td><td>marcata con eGFP espressa in background Mms19p</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington stock center</td><td>#3605</td><td>wild-type stock (w;+;+)</td></tr><tr><td>Anticorpi</td><td></td><td></td> primari <td>Diluizione Ratto</td></tr><tr><td>anti-Miranda</td><td>Abcam</td><td>Ab197788</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Rabbit anti-pH3</td><td>Cell Signaling</td><td>9701</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Anticorpi secondari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rat Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>112-165-167</td><td>1/150</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A27034</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Reagent/Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Supporto supporto supporto</td><td>supporto Polysciences Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Kit di incorporazione Click-it EdU, Alexa Flour 647</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) frazione V Merck</td><td></td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fischer Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>detergente non ionico</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (Imagej)</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRISM</td><td>Graph pad</td><td>software Versione 5</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft office</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 microscopio confocale a scansione laser con obiettivo plan-apochromat 63x a immersione in olio, 1,4 NA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mezzo di montaggio Mezzo</td><td></td><td></td> di <td>montaggio solubile in acqua, non fluorescente</td></tr><tr><td>Piastra</td><td></td><td></td><td></td>spot in vetro a depressione Pyrex 3 o 9</tr><tr><td>Carta</td><td></td><td></td><td></td> da filtro Whatman</tr></tbody></table>

protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina/fosfo-istone h3 per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

L'analisi della progressione del ciclo cellulare in vivo viene eseguita di routine in studi sui geni che regolano la mitosi e la replicazione del DNA. La 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) è stata utilizzata per studiare la progressione replicativa / fase S, mentre gli anticorpi contro il fosfo-istone H3 sono stati utilizzati per marcare nuclei e cellule mitotiche. Una combinazione di entrambe le etichette consentirebbe la classificazione delle fasi G0/G1 (fase Gap), S (replicativa) e M (mitotica) e servirebbe come strumento importante per valutare gli effetti dei knockdown dei geni mitotici o dei mutanti nulli sulla progressione del ciclo cellulare. Tuttavia, i reagenti utilizzati per contrassegnare le cellule marcate con EdU sono incompatibili con diversi tag fluorescenti anticorpali secondari. Ciò complica l'immunocolorazione, in cui gli anticorpi primari e secondari marcati vengono utilizzati per contrassegnare le cellule mitotiche pH3-positive. Questo documento descrive un protocollo passo-passo per la doppia etichettatura di EdU e pH3 nelle cellule staminali neurali larvali di Drosophila, un sistema ampiamente utilizzato per studiare i fattori mitotici. Inoltre, viene fornito un protocollo per l'analisi e la quantificazione delle immagini per allocare le cellule etichettate in 3 categorie distinte, G0 / G1, S, S >G2 / M (progressione da S a G2 / M) e M fasi.

Il cervello larvale bilobato di Drosophila terzo instar è stato utilizzato come sistema modello per studiare i processi cellulari e di sviluppo fondamentali9. L'obiettivo del presente studio è stato quello di presentare un protocollo per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nei NB marcati con EdU e pH3 della regione CB (Figura 1). I CB NB sono suddivisi in tipo I e tipo II e presentano il caratteristico modello di divisione asimmetrica<sup class="...

L'analisi del ciclo cellulare con etichettatura 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) e fosfo-istone H3 (pH3) è una procedura in più fasi che può richiedere un'ampia ottimizzazione. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive tutti i passaggi per questa procedura, compresa l'analisi e la quantificazione delle immagini per distinguere le cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.

Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina/fosfo-istone H3 per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

In questo protocollo, non solo forniamo una spiegazione dettagliata di ogni fase dell'incorporazione e dell'immunocolorazione EDU, ma spieghiamo anche l'acquisizione delle immagini, l'elaborazione delle immagini e forniamo alcuni suggerimenti per l'analisi di set di dati di grandi dimensioni. Questa tecnica consente l'allocazione delle cellule nelle fasi G1, S e M. Ciò sarà particolarmente utile per l'analisi del ciclo cellulare su studi su non mutazioni che colpiscono i geni mitotici.Ci aspetteremmo che le persone lottino per due o tre mesi se non hanno conoscenze o esperienze precedenti con questa tecnica. Per iniziare, aggiungi il mezzo di dissezione o SM di Schneider a due depressioni consecutive di una piastra spot lucida e aggiungi PBS alla depressione successiva. Usando un paio di pinze, scegli le larve di terza stella vaganti e posizionale su un tessuto ratto con PBS per pulire i residui di cibo della mosca.Posizionare la larva nella depressione con PBS seguita dalla depressione consecutiva contenente SM. Successivamente, al microscopio di dissezione, utilizzare una pinza fine per rimuovere tre quarti della parte inferiore del corpo della larva. Quindi afferrare delicatamente i ganci della bocca larvale con un paio di pinze e tenere la cuticola dell'altra estremità con l'altro paio di pinze. Ruotare la testa larvale verso l'esterno spingendo i ganci della bocca verso l'interno e contemporaneamente staccando il tessuto all'altra estremità.Osserva il cervello larvale con dischi immaginali attaccati. Rimuovere altri tessuti attaccati al cervello e trasferire il cervello alla successiva depressione consecutiva con SM. Aggiungere 100 microlitri di 100 micromolari EDU SM soluzione a un'altra depressione sulla piastra Pyrex e incubare circa 5-10 cervelli sezionati in questa soluzione per 2 ore a 25 gradi Celsius. Dopo la fissazione e l'immunocolorazione rimuovere PBST e aggiungere il cocktail di rilevamento EDU al cervello sezionato.Quindi incubarli a temperatura ambiente al buio su un neutater. Dopo 30 minuti, lavare i campioni due volte con PBST per 10 minuti per lavaggio al buio. Per la colorazione del DNA, preparare 5 microgrammi per millilitro di soluzione di Hoechst 33342.Rimuovere PBST dopo il secondo lavaggio e aggiungere 500 microlitri della soluzione di Hoechst al cervello sezionato, quindi incubarli al buio. Dopo 10 minuti, rimuovere l'Hoechst e lavare i campioni con PBST per 10 minuti. Tocca il tubo sul banco di laboratorio e lascia che il cervello si stabilizzi.Rimuovere il PBST dal tubo, lasciando dietro di sé da 50 a 100 microlitri. Tagliare l'estremità di una punta di microtubetto da 200 microlitri e usarla per trasferire il cervello su un vetrino pulito. Rimuovere l'accesso PBST dalla diapositiva tamponandola con strisce di carta da filtro.Non lasciare che la carta da filtro tocchi il cervello. Metti una goccia di un mezzo di montaggio solubile in acqua e non fluorescente sul cervello e orienta il cervello in modo tale che il cordone nervoso ventrale sia rivolto verso lo scivolo e i lobi rivolti verso l'alto. Disporre i cervelli in un unico file in modo che sia più facile visualizzare il cervello in serie.Posizionare delicatamente una copertura sulla parte superiore del cervello e incubare la diapositiva durante la notte a 2-6 gradi Celsius. Dal software di acquisizione selezionare l'obiettivo 63 volte. Metti una goccia di olio per immersione sul coperchio appena sopra il cervello montato per rendere più facile individuare il tessuto attraverso l'oculare.Utilizzando il canale dappy Hoechst 33342, trova il cervello attraverso l'oculare e quindi passa alla modalità di acquisizione nel software. Imposta 4 canali per l'immagine hoechst 33342, Alexa piano 4 8 8, Alexa piano 5 6, 8 e Alexa piano 6 4 7. Utilizzare lo strumento dye assistant per impostare automaticamente i laser di eccitazione dei coloranti selezionati e i filtri di emissione.Imposta il campo visivo, in modo tale che comprenda l'intero lobo cerebrale. Immagina l'intero volume del lobo cerebrale acquisendo questa tassa distanziata di 0,8 micron l'una dall'altra. Memorizza tutte le immagini di una sessione di imaging in un formato di libreria punto L I F.Per l'analisi delle immagini, apri Fiji, quindi trascina e rilascia i file LIF in Fiji. Seleziona il browser dei dati dalla scheda di visualizzazione dello stack e utilizza lo stack virtuale dalla scheda di gestione della memoria nel plug-in dei formati bio. Osservare l'immagine multicanale visualizzata nell'immagine J.Modificare il colore dei canali dalla barra dei menu, utilizzando lo strumento immagine, colore e canali.E monitorare i neuroblasti marcati Miranda, che appaiono come grandi cellule rotonde nella regione centrale del cervello. Disegna una regione di interesse usando lo strumento ellisse su ciascun neuroblasto per evitare di contare il neuroblasto due volte. Dalla barra dei menu dell'immagine J, selezionare analizza, strumenti e ROI manager.Contrassegnare tutti i neuroblasti nella sezione Z corrente e premere T dopo aver contrassegnato ogni cellula. Una volta che tutti i neuroblasti nell'attuale sezione Z sono marcati, cambiare i canali in pH3 ed EDU e contare manualmente il numero di neuroblasti EDU positivi, neuroblasti pH3 positivi, neuroblasti EDU e pH3 positivi e neuroblasti non macchiati per nessuno dei due marcatori. Cerca i neuroblasti e le sezioni Z successive, elimina i vecchi ROI e aggiungi nuovi ROI per contare i neuroblasti in diversi stack.Preparare un foglio di calcolo e calcolare le percentuali di neuroblasti presenti in tutte e quattro le categorie per ciascun lobo. Prepara un grafico a barre utilizzando il software per fogli di calcolo, mostrando i dati dei pool per le percentuali di neuroblasti in ogni categoria. I neuroblasti cerebrali centrali del cervello larvale terzo instar contrassegnati con Miranda, EDU e pH3 sono mostrati qui.Le celle sono state assegnate alle fasi G1/G0, S, SG2/M e M. Nell'analisi EDU pH3, una percentuale significativamente più alta di MMS19, i neuroblasti di perdita di funzione sono stati trovati nella fase M rispetto ai neuroblasti wild type. L'espressione MMS19:eGFP nello sfondo della perdita di funzione MMS19 ha salvato la proporzione di cellule in fase M a livelli wild type.È importante non usare cervelli danneggiati per i passaggi successivi. E la soluzione ED deve essere preparata appena prima di iniziare le dissezioni. Questa risorsa può essere utilizzata come un rapido screening iniziale per identificare i difetti in specifiche fasi del ciclo cellulare.Questo potrebbe quindi essere seguito da un'analisi più dettagliata di una particolare fase.

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Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2-deossiuridina/fosfo-istone H3 per lanalisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila (Video) | JoVE Journal

Protocollo a doppia marcatura 5-etinil-2'-deossiuridina/fosfo-istone H3 per l'analisi della progressione del ciclo cellulare nelle cellule staminali neurali della drosofila

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