Name: Implementazione AAV di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Scopri l'implementazione di costrutti AAV basati su enhancer nel cervello di topo per visualizzare l'espressione genica guidata da enhancer. Questo metodo rapido permette di valutare l'attività e la localizzazione degli enhancer in vivo.

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Il sequenziamento è stato eseguito presso la UC Davis DNA Technologies Core. Ringraziamo il laboratorio di Lin Tian alla UC Davis per la formazione sul packaging rAAV e per averci generosamente regalato plasmidi aiutanti AAV e rep/cap. Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIGMS R35GM119831.

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive un metodo basato su rAAV per il dispiegamento di transgeni guidati da enhancer nel cervello postnatale del topo. In questo protocollo generalizzato, un potenziatore candidato, un promotore minimo, un gene reporter e una sequenza di codici a barre opzionale vengono clonati in una spina dorsale del plasmide AAV. Questi esperimenti possono essere fatti con una singola sequenza di potenziatore candidato o con molte sequenze in parallelo. Il plasmide viene confezionato in un rAAV e consegnato al cer...

Gli enhancer sono elementi cis-regolatori genomici che fungono da siti di legame del fattore di trascrizione e possono guidare l'espressione di un gene bersaglio in modo spazio-temporale specifico 1,2. Sono differenzialmente attivi in diversi tipi cellulari, tessuti e stadi di sviluppo e possono essere substrati della variazione genomica correlata al rischio di malattia 3,4. Pertanto, la necessità di comprendere le dinamiche della funzione enhancer è fondamentale per il progresso nelle applicazioni sia traslazionali che scientifiche di base all'interno della genomica. In silico le previsioni dell'attività dell'enhancer possono servire come risorse eccellenti per generare ipotesi come capacità di enhancer 5,6. Tale attività di enhancer prevista può richiedere ulteriori validazioni e interrogazioni per una piena comprensione dell'attività funzionale. I saggi Enhancer reporter si sono dimostrati preziosi per questo scopo in una varietà di sistemi, dalle cellule agli animali 7,8,9. Per estendere questi studi in un contesto transitorio in vivo flessibile ed economico, questo protocollo descrive l'uso di metodi basati su AAV in vivo per testare sequenze di potenziatori putativi per la loro capacità di guidare l'espressione di un gene reporter ectopico nel cervello postnatale del topo. Questa famiglia di metodi ha utilità per interrogare singole sequenze candidate o screening di librerie parallele ed è rilevante per la ricerca di base e traslazionale.
Questo metodo combina in un singolo plasmide una presunta sequenza di DNA candidato enhancer con un gene reporter (qui EGFP), sotto il controllo di un promotore minimo che da solo non guida l'espressione significativa. Il plasmide viene confezionato in AAV ricombinante (rAAV) e iniettato in un modello animale. Mentre l'applicazione qui è al cervello, vari sierotipi rAAV consentono l'infezione attraverso diversi tipi di tessuto in modo che questo approccio possa essere esteso ad altri sistemi10. Dopo un periodo di tempo, il cervello può essere raccolto e analizzato per l'espressione del gene reporter. L'espressione forte, rispetto ai controlli, indica che la sequenza candidata testata è stata in grado di "migliorare" l'espressione del gene (Figura 1). Questo semplice design offre un approccio semplice e chiaro per testare una sequenza per l'attività del potenziatore in vivo nel cervello.
Oltre a testare la capacità di enhancer di una sequenza, questo metodo può essere combinato con tecniche per determinare l'attività del potenziatore di tipo cellulare. Negli approcci basati sulla sequenza per determinare l'attività del potenziatore differenziale, l'ordinamento delle cellule su marcatori specifici del tipo di cellula prima del sequenziamento del DNA e dell'RNA può consentire ai ricercatori di determinare se diversi tipi di cellule mostrano attività di potenziatore differenziale, come è stato descritto in Gisselbrecht et al.11. Negli approcci basati sull'imaging, la co-etichettatura delle immagini con marcatori specifici del tipo di cellula consente di esaminare se le cellule che mostrano fluorescenza guidata dal potenziatore mostrano anche marcatori di tipo cellulare di interesse 12,13,14,15,16. I saggi dei reporter enhancer consentono di testare direttamente la variazione allelica associata al rischio nei potenziatori per gli effetti sulla capacità del potenziatore. La stragrande maggioranza dei loci di rischio identificati negli studi di associazione genome-wide (GWAS) si trova in regioni non codificanti del genoma17. Studi di annotazione funzionale di questi loci di rischio indicano che una grande porzione probabilmente agisce come potenziatori18,19,20. Il dispiegamento di MPRA in vivo può consentire di testare queste varianti associate al rischio per l'attività del potenziatore nel cervello12,21. Infine, la consegna e la raccolta in diversi momenti possono offrire approfondimenti sulle fasi di sviluppo durante le quali un potenziatore è attivo.
I design dei plasmidi enhancer-reporter sono diversi e possono essere personalizzati per soddisfare obiettivi sperimentali. Ci sono diverse opzioni per i promotori minimi che sono stati utilizzati nella ricerca sugli enhancer, come il promotore minimo umano β-globina22 e il promotore minimo Hsp68 del topo23. Questi promotori sono noti per guidare bassi livelli di espressione a meno che non siano accoppiati con un elemento enhancer per attivarli. Al contrario, gli elementi promotori costitutivi guidano una forte espressione del transgene, utile per il controllo positivo o per testare la funzione enhancer su uno sfondo di espressione robusta. Le scelte comuni per i promotori costitutivi includono CAG, un promotore ibrido derivato dal promotore di pollo β-actina e dal citomegalovirus immediate-early enhancer24, o EF1α25 umano. Poiché è noto che i potenziatori funzionano in modo bidirezionale26, l'orientamento e la posizione del potenziatore rispetto al promotore minimo sono flessibili (Figura 2A). I tradizionali saggi enhancer-reporter posizionano il enhancer a monte del promotore e, nelle consegne in libreria, includono una sequenza di codici a barre a valle del gene reporter per associare le letture di sequenziamento con il enhancer27 testato. Tuttavia, gli enhancer possono anche essere posizionati nel frame di lettura aperto del gene reporter e fungere da sequenza di codici a barre, come viene fatto in STARR-seq28. Il protocollo qui descritto utilizza il disegno del saggio STARR-seq, posizionando la sequenza del potenziatore candidato nel 3' UTR del gene reporter. Mentre l'orientamento STARR-seq offre il vantaggio di una clonazione più snella, è meno compreso rispetto all'approccio convenzionale e può indurre stabilità variabile dell'RNA tra i costrutti. I metodi descritti possono essere facilmente adattati sia allo STARR-seq che all'orientamento convenzionale con piccole modifiche al processo di clonazione che sono state descritte altrove27,29.
Diversi metodi di erogazione di AAV possono essere impiegati per personalizzare ulteriormente questa tecnica per adattarla agli obiettivi sperimentali (Figura 2B). Le iniezioni intracraniche dirette, descritte ulteriormente in questo protocollo, forniscono un'alta concentrazione di virus direttamente al cervello30. Ciò fornisce un'elevata efficienza di trasduzione centrata nel sito di iniezione, rendendola una tecnica eccellente per esperimenti che cercano di massimizzare la densità delle cellule trasdotte su un'area di tessuto. L'iniezione stereotassica può aiutare a standardizzare il sito di iniezione tra gli animali per una trasduzione localizzata riproducibile. Le iniezioni intracraniche sono più semplici negli animali postnatali precoci. Come tecnica alternativa, le iniezioni sistemiche possono fornire transgeni utilizzando AAV con sierotipi in grado di attraversare la barriera emato-encefalica31. Le iniezioni di vene della coda consentono al virus di circolare in tutto il corpo, consentendo la consegna generalizzata attraverso molti tessuti10. Le iniezioni retro-orbitali sono un'altra tecnica di iniezione sistemica che trasporta il virus dietro l'occhio nel seno retroorbitale32. Ciò offre un percorso più diretto per l'AAV dal sistema venoso al cervello, con conseguente maggiore concentrazione di cellule trasdotte nel cervello rispetto alle iniezioni in più vasi sanguigni periferici33.
Un altro aspetto flessibile di questa tecnica è il metodo di lettura. In generale, le opzioni possono essere descritte come basate su reporter o sequenziali (Figura 2C). L'incorporazione di un reporter fluorescente come GFP nel frame di lettura aperto del costrutto si traduce nell'espressione della proteina fluorescente in qualsiasi cellula trasdotta in cui il candidato enhancer ha guidato l'espressione. Le tecniche di etichettatura e imaging come l'immunoistochimica consentono l'amplificazione del segnale. Le tecniche di lettura basate sul sequenziamento comportano l'identificazione di sequenze dal costrutto consegnato nell'RNA raccolto dal tessuto. Quantificando la quantità di DNA virale che è stata inizialmente consegnata, il confronto tra RNA espresso e DNA consegnato può essere utilizzato per determinare il grado in cui una sequenza enhancer testata era in grado di guidare una maggiore espressione del transgene, ad esempio, nel contesto di un saggio reporter massively parallel (MPRA). Gli MPRA offrono una potente espansione di queste tecniche per testare fino a migliaia di candidati potenziatori per l'attività contemporaneamente e sono stati ampiamente descritti nella ricerca genomica 12,27,34,35,36. Lo screening a throughput più elevato si ottiene eseguendo fasi di clonazione, confezionamento, consegna e sequenziamento per i potenziatori candidati in batch anziché singolarmente.
La selezione del potenziatore dei candidati offre un'altra opportunità di flessibilità (Figura 2D). Ad esempio, questo test può essere utilizzato per identificare i potenziatori di un gene specifico, per accertare la funzione delle regioni di interesse del DNA non codificanti o per determinare specifici tipi di cellule o fasi di sviluppo durante le quali un potenziatore è attivo - tutti elementi che servono obiettivi sia nella scienza di base che nella ricerca sulle malattie. Generalmente, la selezione del potenziatore candidato è guidata dalle previsioni in silico dell'attività del potenziatore. Comunemente, le previsioni in silico includono ChIP-seq per le modifiche degli istoni che indicano probabili potenziatori, come H3K27ac37 e la mappatura dell'accessibilità della cromatina38. Infine, un'area di ricerca crescente è lo screening basato sulla funzione di elementi enhancer progettati sinteticamente, consentendo studi su come la sequenza enhancer dirige la funzione39 e la progettazione di enhancer con proprietà specifiche40.

<table><tbody><tr><td>10x Tampone Citrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9999-1000ML</td><td></td></tr><tr><td>5'-gatcactctcggcatggac-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A: Primer Forward progettato su misura</td><td>per la verifica dei cloni dopo la trasformazione. Questi primer sono specifici per il vettore utilizzato e sono stati progettati per il vettore specifico utilizzato nei nostri esperimenti.</td></tr><tr><td>5'-gatggctggcaactagaagg-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies</td><td>N/A:</td><td>Primer inverso progettato su misura per la verifica dei cloni dopo la trasformazione. Questi primer sono specifici per il vettore utilizzato e sono stati progettati per il vettore specifico utilizzato nei nostri esperimenti.</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>VWR</td><td>VWRVN605-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tubi aspiratori</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td>per l'erogazione orale di rAAV</td></tr><tr><td>Piastre di Petri batteriologiche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pollo IgY anti-GFP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td>Le immagini sono state scattate sul modello LSM800, ma Zeiss ha lanciato il modello LSM900 negli ultimi anni per sostituire LSM800.</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche 15 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9806558</td><td>Questi stampi sono adatti per il cervello di topo P28. Altre dimensioni possono essere più adatte per tessuti più grandi o più piccoli.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, 4,5"</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-pollo AlexaFlour-488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS 1x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Provette per microcentrifuga 2,0 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>22431048</tr><tr><td>Falcon provette a fondo tondo 14 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green colorante</td><td>Grainger</td><td>F0099-1G</td><td></td></tr><tr><td>Set di pennelli per dettagli fini</td><td>Artbrush Tower</td><td>B014GWCLFO</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari in vetro</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Kit maxi plasmidico HiSpeed</td><td>QIAGEN</td><td>12663</td><td>Kit maxi preparazione plasmidi commerciali</td></tr><tr><td>HyClone HyPure Acqua di biologia molecolare</td><td>VWR</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>IV set per infusione a farfalla con tubo da 12" e ago da 25G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>Salvietta senza lanugine</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td>LB premiscela di agar per terreni selettivi</td></tr><tr><td>McPherson Vannas forbice per iride</td><td>Integra LifeSciences</td><td>360-215</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma Life Science</td><td>69794-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NEB Stabile Competente E. coli</td><td>NEB</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-Up</td><td>Takara</td><td>740609.5</td><td>Kit per reazione enzimatica terreno di pulizia ed estrazione del gel</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale</td><td>Cole Parmer</td><td>60-100</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Provette per strisce PCR 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson</td><td>F155005</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific 70011044</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere</td><td>Sunny Select</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Tampone</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Tampone per digesto di restrizione con PacI, AscI e XmaI</td></tr><tr><td>Enzima di restrizione: AscI</td><td>NEB</td><td>R0558L</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione: PacI</td><td>NEB</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>Enzima di restrizione: XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita SOC</td><td>NEB</td><td>B0920S</td><td>Terreno di recupero dopo la trasformazione</td></tr><tr><td>Saccarosio ( Senza RNasi/DNasi)</td><td>Millipore Sigma</td><td>033522.5KG</td><td></td></tr><tr><td>tampone TAE</td><td>Apex</td><td>20-194</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di trasferimento</td><td>Gilson</td><td>F1179941</td><td>Per pompa peristaltica</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps Sistema di purificazione del DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1460</td><td>Mini kit di preparazione del plasmide</td></tr></tbody></table>

implementazione aav di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Gli enhancer sono piattaforme di legame per una vasta gamma di fattori di trascrizione che guidano specifici modelli di espressione di geni specifici del tipo di tessuto e della cellula. Molteplici mezzi per valutare il DNA non codificante e vari stati della cromatina si sono dimostrati utili nel predire la presenza di sequenze enhancer nel genoma, ma convalidare l'attività di queste sequenze e trovare gli organi e gli stadi di sviluppo in cui sono attivi è un processo ad alta intensità di lavoro. I recenti progressi nei vettori del virus adeno-associato (AAV) hanno permesso la consegna diffusa di transgeni ai tessuti del topo, consentendo test di potenziatori in vivo senza la necessità di un animale transgenico. Questo protocollo mostra come un costrutto reporter che esprime EGFP sotto il controllo di un promotore minimo, che non guida l'espressione significativa da solo, può essere utilizzato per studiare i modelli di attività delle sequenze di potenziatori candidati nel cervello del topo. Un costrutto reporter confezionato AAV viene consegnato al cervello del topo e incubato per 1-4 settimane, dopo di che l'animale viene sacrificato e le sezioni cerebrali vengono osservate al microscopio. EGFP appare nelle cellule in cui il potenziatore testato è sufficiente per avviare l'espressione genica, individuando la posizione e lo stadio di sviluppo in cui il potenziatore è attivo nel cervello. I metodi di clonazione standard, l'imballaggio AAV a basso costo e l'espansione dei sierotipi e dei metodi AAV per la consegna in vivo e la lettura standard dell'imaging rendono questo un approccio accessibile per lo studio di come l'espressione genica è regolata nel cervello.

Utilizzando questi metodi, una sequenza di 915 bp nel terzo introne associato al rischio psichiatrico del gene CACNA1C19,49,50 è stata testata per l'attività del potenziatore nel cervello del topo postnatale. Questa sequenza è stata scoperta in un MPRA di 345 sequenze di potenziatori candidati centrate sul rischio psichiatrico e neurologico SNPs12 e gli esperimenti di caratterizzazione sono descr...

Questo protocollo descrive un nuovo test di enhancer-reporter transitorio basato su rAAV. Questo test può essere utilizzato per indurre l'espressione guidata dal potenziatore in vivo nel cervello del topo.

Implementazione AAV di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...

Questo protocollo è significativo perché consente di visualizzare non solo se una sequenza enhancer può guidare l'espressione, ma dove può guidare l'espressione in una particolare parte del corpo. È veloce. Le iniezioni richiedono meno di 10 minuti per essere completate e se e dove viene espresso un gene reporter può essere visto entro pochi giorni dalla raccolta del campione.Per iniziare la clonazione, scegliere o progettare un costrutto reporter. Il costrutto utilizzato qui colloca il candidato enhancer nelle tre regioni principali non tradotte di un gene reporter EGFP espresso sotto il controllo del promotore minimo hsp68. Per progettare i primer PCR per amplificare una sequenza di interesse e clonazione nel vettore, aggiungere il braccio di omologia appropriato per la clonazione di Gibson alle cinque estremità prime dei primer.Utilizzando i primer progettati, eseguire la PCR da un campione di DNA. Digerire da uno a 10 microgrammi di DNA vettoriale usando Pac1 e Asc1, a seconda del numero desiderato di reazioni di clonazione richieste. Impiegando elettroforesi su gel dallo 0,7 all'1% per 30-60 minuti a 100 volt, separare i frammenti di digestione di restrizione.Estrarre la banda per il vettore linearizzato e purificarla con un kit di estrazione gel commerciale. Una volta completata la clonazione di Gibson e la trasformazione delle cellule, placcare le cellule su terreni selettivi e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Dopo aver verificato la riuscita clonazione del costrutto reporter, inoculare cinque millilitri della coltura starter utilizzando lo stock di glicerolo.Coltiva la coltura da otto a 16 ore in un'incubatrice vibrante a 30 gradi Celsius e 180 rotazioni al minuto. Quando il brodo diventa torbido, diluire la coltura starter 1.000x in 250-300 millilitri di brodo LB fresco selettivo e incubarlo durante la notte in un'incubatrice vibrante a 30 gradi Celsius e 180 rotazioni al minuto. Utilizzando un maxi kit plasmidico commerciale, purificare il plasmide.Per testare la ricombinazione degli ITR, eseguire una digestione Xma1. Visualizza le bande. Assicurati che il tuo digest mostri il numero previsto di bande.La ricombinazione si tradurrà in un numero inferiore di bande rispetto al previsto. Preparare la miscela AAV ricombinante per la consegna. Se si confrontano i modelli di espressione di più virus enhancer reporter, diluire ciascun virus per equiparare i titoli dei virus al virus meno concentrato.Mescolare il virus enhancer reporter e il virus reporter di controllo costitutivamente espresso in un rapporto di due a uno o tre a uno. Aggiungere una piccola quantità di colorante verde veloce con una concentrazione finale dello 0,06%Rompere la punta di una pipetta di vetro tirata ricavata da un tubo capillare graduato da microlitri forandola delicatamente in una salvietta delicata e priva di lanugine. Inserire la pipetta in un gruppo aspiratore con un dispositivo di applicazione della pressione collegato a una guarnizione di gomma per contenere una pipetta microcapillare.Aspirare un piccolo volume di circa 0,2-0,5 microlitri di olio minerale nella pipetta applicando una pressione negativa attraverso l'aspiratore. Tenere da parte il gruppo aspiratore e posizionare il virus sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'iniezione. Dopo la crio-anestetizzazione dei topi neonatali, applicare una pressione negativa utilizzando il gruppo aspiratore e aspirare la miscela virale nella pipetta di vetro tirata fino a quando il menisco supera il segno di zecca di due microlitri.Allontanare il mouse dalla camera fredda e posizionarlo sul banco. Individuare i siti di iniezione bilaterale a metà strada tra lambda e bregma, così come la sutura sagittale e ciascun occhio. Disinfettarli usando una salvietta imbevuta di alcool.Forare il cranio dei topi neonatali usando la pipetta di vetro tirata. Quando l'ago entra nel cranio, applicare una pressione positiva attraverso il gruppo aspiratore. Erogare un microlitro di virus nel ventricolo laterale e ritirare la pipetta.Posizionare il mouse su una piastra elettrica o una camera di riscaldamento per recuperare. Riporta l'animale nella gabbia di casa una volta risvegliato. Registra immagini a fluorescenza che attraversano la sezione cerebrale utilizzando una lente soggettiva 5x a basso ingrandimento.Localizzando il sito di iniezione, valutare l'entità della trasduzione del virus, a seconda della densità e dell'intensità dei globuli fluorescenti rossi. Confronta gli animali che sono stati trasdotti in modo simile. Registra immagini fluorescenti con un obiettivo di ingrandimento superiore a 25x.Quindi, apri il software di analisi e applica un filtro mediano tre per tre per ridurre il rumore. Fare clic sul menu Processo, quindi fare clic su Rumore e scegliere l'opzione Dispeckle. Successivamente, per sottrarre la fluorescenza di fondo dalle immagini, iniziare separando i canali di un'immagine multicanale.Fare clic sul menu Immagine, quindi fare clic su Colore e selezionare l'opzione Dividi canali. Utilizzando lo strumento di selezione del rettangolo o del cerchio, disegnate una piccola forma in un'area dell'immagine senza celle fluorescenti. Misurare l'intensità media dei pixel dello sfondo facendo clic su Analizza, quindi su Misura, quindi ripetere per campionare più volte.Calcolare la media del valore di grigio da cinque a otto aree di sfondo e ridurre i valori decimali. Sottrarre i valori da ciascun pixel dell'immagine selezionando il menu Processo, quindi fare clic su Matematiche e Sottrai. Quindi, immettere il valore di sfondo da sottrarre e fare clic su OK. Se necessario, unire nuovamente i canali in un'immagine multicanale selezionando il menu Immagine, quindi fare clic su Colore e selezionare Unisci canali.Per contare il numero di cellule fluorescenti verdi, nascondere il canale verde e disegnare una forma attorno alla regione del cervello che esprime la fluorescenza rossa utilizzando lo strumento di selezione a forma libera. Fare clic sulla funzione Misura per misurare l'area, la densità integrata e il valore medio di grigio del canale rosso nella zona selezionata. Contare il numero di celle verdi utilizzando uno strumento di selezione multipunto e normalizzare il numero di celle verdi in base all'intensità integrata del canale rosso.Dopo aver trasdotto, il reporter enhancer che il topo ha iniettato per via intracranica a P0 con un costrutto AAV positivo ha mostrato un'espressione di EGFP guidata dall'enhancer negli strati inferiori medi della corteccia 28 giorni dopo l'iniezione. Il topo iniettato con un costrutto di controllo negativo a P0 non mostra alcuna espressione di EGFP 28 giorni dopo l'iniezione, dimostrando che gli elementi enhancer sono trovati per guidare la trascrizione di EGFP nel cervello del topo. Per visualizzare con successo l'area trasdotta e controllare la potenziale variabilità, sono state esaminate le librerie di reporter enhancer fornite da AAV di diversi titoli.La libreria di titoli elevati dei potenziatori candidati guida un'ampia espressione di EGFP mentre la libreria di titoli più bassi di potenziatori candidati guida l'espressione CGFP sparsa nel cervello del topo P7. È fondamentale mescolare il reporter potenziatore AAV con il controllo positivo ad ogni iniezione per distinguere tra potenziatori senza attività e parti falliti. Questa procedura può essere abbinata a immunoistochimica, RNA FISH o sequenziamento dell'RNA a singola cellula per determinare in quali tipi di cellule è attivo un potenziatore.

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