Differenziazione e polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M2-like utilizzando una linea cellulare di leucemia THP-1 simile a un monocita umano

I macrofagi associati al tumore antinfiammatorio sono legati alla progressione e alla prognosi sfavorevole nel cancro. Questo protocollo è una guida per differenziare e polarizzare le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi simili a M2 entro 14 giorni. Attualmente non esiste un modello stabilito per la polarizzazione antinfiammatoria THP-1.

Questo protocollo utilizza adeguati periodi di riposo e un processo di polarizzazione prolungato per creare un sottotipo di macrofagi distinto simile a M2. Lo sviluppo del tumore, ad esempio, nel cancro del colon e nel rimodellamento dei tessuti, è controllato da macrofagi antinfiammatori. Tra gli studi che indagano sulla loro funzione, la creazione standardizzata di un sottotipo distinto simile a M2 garantisce risultati riproducibili.

Inizia impostando un timer per 150 secondi. Rimuovere il flaconcino congelato contenente la linea cellulare THP-1 dall'azoto liquido e scongelare immediatamente il flaconcino a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua pulita, avviando il timer non appena il flaconcino viene messo nel bagno d'acqua. Allentare il tappo per rilasciare la pressione accumulata a causa del processo di scongelamento, assicurando che l'apertura del tubo non contatti l'acqua per evitare la contaminazione.

Scongelare la sospensione cellulare fino a lasciare un chip di ghiaccio di circa quattro millimetri all'interno del flaconcino e procedere immediatamente al passaggio successivo. Trasferire la fase liquida della sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri contenente nove millilitri di mezzi di crescita caldi. Quindi trasferire un millilitro di questa sospensione a celle medie calde nel flaconcino THP-1 e di nuovo nel tubo da 15 millilitro per sciogliere il chip di ghiaccio rimanente e lavare la fiala per assicurarsi che non vengano lasciate indietro le cellule.

Mescolare delicatamente la sospensione pipettandola su e giù con una pipetta da un millilitro. Rimuovere circa 10 microlitri del campione per contare le cellule per la vitalità usando il tripano blu. Le cellule con citoplasma chiaro sono vitali, un citoplasma blu indica la morte cellulare.

Durante il conteggio, ruotare verso il basso la sospensione a celle calde a 200 volte G per sette minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere completamente il surnatante e risospentare le cellule nel mezzo di crescita per ottenere una densità cellulare di 500.000 cellule per millilitro. Mescolare delicatamente la sospensione e trasferire 22 millilitri in palloni di coltura cellulare T75 ciascuno.

Conservare i palloni in posizione verticale in un incubatore a 37 gradi Celsius con una concentrazione di anidride carbonica del 5% e scambiare i mezzi di crescita ogni tre o quattro giorni. Preparare la sospensione cellulare per seminare le cellule ad una densità di 300.000 per millilitro per pozzetto in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti. Mescolare delicatamente il mezzo e preparare aliquote di 26 millilitri in tubi da 50 millilitri.

Trasferire un millilitro del mezzo contenente cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Mescolare delicatamente il supporto pipettandolo su e giù tra un trasferimento e l'altro. Mantenere la soluzione di lavoro appena preparata di PMA sul ghiaccio e aggiungere 100 nanogrammi di PMA per pozzetto.

Incubare le piastre nell'incubatrice senza ulteriori trattamenti per 72 ore. Dopo 72 ore, rimuovere il terreno di crescita e sostituirlo con un millilitro di terreno di crescita fresco, assicurandosi di non toccare il fondo dei pozzetto con punte di pipetta. Lasciare riposare le cellule per altre 96 ore nell'incubatrice.

Rimuovere il mezzo di crescita e sostituirlo con un millilitro di terreno di crescita fresco. Aggiungere 20 nanogrammi di interleuchina 4 e 20 nanogrammi di interleuchina 13 per pozzo. Quindi lasciare riposare le cellule per 48 ore nell'incubatrice.

Ripeti l'intero processo dopo 48 ore e lascia riposare le cellule per altre 48 ore nell'incubatrice. Rimuovere il mezzo di crescita e sostituirlo con un millilitro di terreno di crescita fresco. Quindi lasciare riposare le cellule per 48 ore nell'incubatrice.

Rimuovere il mezzo cellulare caldo da ciascun pozzetto e sostituirlo con una miscela di un millilitro di PBS ghiacciato senza calcio e magnesio e 5% FBS. Quindi posizionare immediatamente la piastra cellulare sul ghiaccio per 45 minuti. Dopo 45 minuti sul ghiaccio, raschiare via le cellule usando mini raschietti per cellule.

Trasferire delicatamente i macrofagi staccati a PBS freddo e 5% FBS in un tubo da 15 millilitro tenuto sul ghiaccio. I macrofagi derivati dal metodo di polarizzazione mostrano l'espressione di CD14, così come i marcatori CD11b. I marcatori monociti e macrofagi CD14 e CD11b sono stati espressi rispettivamente nel 70,9% e nel 74,7% delle cellule.

Le cellule hanno mostrato bassi livelli superficiali del marcatore M1-like CD80 nello 0,2% delle cellule e alti livelli superficiali del marcatore M2-like CD206 nel 62,6% delle cellule. Poiché le cellule THP-1 nel mezzo tendono ad affondare sul fondo di una fiala e sono facili da attivare attraverso lo stress meccanico, è importante una miscelazione e una manipolazione delicate delle cellule. I macrofagi simili a M2 sono creati in modo riproducibile e sono stati caratterizzati utilizzando QR-TPCR, ELISA e citometria a flusso.

Questa è la base per studiare i meccanismi anti-infiammatori nello sviluppo del cancro o nel rimodellamento dei tessuti.