Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).

Le cellule epatociti derivate da cellule staminali embrionali umane sono utili nella modellazione delle malattie e nello screening farmacologico. Si tratta di un metodo efficiente e riproducibile per indurre efficacemente la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in cellule funzionali simili a epatociti. Uno stato indifferenziato e un'adeguata confluenza di cellule staminali embrionali umane sono fondamentali per una differenziazione riuscita alle cellule simili agli epatociti.

Per il mantenimento delle cellule staminali, rivestire piastre sterili trattate con coltura tissutale a sei pozzi con un millilitro di Matrigel qualificato per cellule staminali embrionali umane 1X per pozzo e conservarle a quattro gradi Celsius durante la notte. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso. Scongelare gli HESE crioconsenti in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per tre minuti senza tremare, quindi trasferire immediatamente le cellule staminali intubandole in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo mTESR preri warmed di 37 gradi Celsius.

Centrifugare gli HESE e aspirare il supernatante, quindi sospendere delicatamente le cellule in un millilitro di mezzo mTESR. Aspirare il mezzo DMEM F-12 dalla piastra. Seminare le cellule in una piastra a sei potte ad una densità di 1 x 10 fino alla 5a cellule in due millilitri di mTESR e incubare in un incubatore di anidride carbonica al 5%.

Mantenere le cellule sostituendo il mezzo con mezzo mTESR preriscaldato ogni giorno. Passare le cellule a circa il 70-80% di confluenza, o quando le colonie cellulari iniziano a prendere contatto. Per le cellule che passano, aspirare il mezzo e incubare le cellule con un millilitro per pozzo di soluzione enzimatica per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Trasferire le cellule tubazioni in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente quattro millilitri di DMEM F-12 prerifatti a 37 gradi Celsius. Preparare piastre da 24 pozzi rivestendole con 250 microlitri di supporto Matrigel qualificato hESC 1X. Seme hESC ad una densità da 1 a 1,5 volte 10 alla 5a cellule per pozzo in 500 microlitri di mezzo mTESR.

Aggiungere entrambe le attività A ad una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro e CHIR99021 ad una concentrazione finale di tre micromolari in un volume appropriato di mezzo di base di differenziazione preriscaldato di fase uno. Dopo tre giorni di differenziazione, le cellule differenziate dovrebbero esprimere marcatori di cellule endodermiche definitive, come FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 e FOXA1. Il terzo giorno di differenziazione, aspirare il mezzo, sostituirlo con il mezzo di fase due e incubare per 24 ore.

Cambia il mezzo a giorni dal quattro all'otto giorni. Dopo otto giorni di differenziazione, le cellule differenziate dovrebbero esprimere marcatori appropriati di cellule progenitrici epatiche, come HNF4 alpha, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. Il primo giorno, aspirare il mezzo di fase due dalle cellule e sostituirlo con il mezzo di fase tre.

Consentire alle cellule di incubare per 10 giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica e cambiare i media a giorni diversi con fattori di differenziazione appena aggiunti. Dopo 18 giorni di differenziazione, le cellule differenziate dovrebbero esprimere marcatori caratteristici di epatociti, come AAT, ALB, TTR, HNF4 alpha, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Viene mostrato il diagramma schematico delle cellule simili agli epatociti degli hESC e delle immagini dei campi luminosi di ogni fase di differenziazione.

Nella prima fase, l'attivina A e la CHIR99021 sono state aggiunte per tre giorni per indurre le cellule staminali a formare cellule endodermiche. Nella seconda fase, le cellule endodermiche si differenziano in cellule progenitrici epatiche dopo essere state trattate con un mezzo di differenziazione per cinque giorni. Nella terza fase, dopo 10 giorni, i primi epatociti erano maturati e differenziati in cellule simili agli epatociti nel fattore di crescita degli epatociti e nell'oncostatina.

Nella fase finale della differenziazione, le cellule hanno mostrato un tipico fenotipo epatocita. RT-PCR, colorazione immunofluorescenza e macchia occidentale sono stati usati per rilevare marcatori di cellule endodermiche, cellule precursori epatiche ed epatociti maturi. Le cellule differenziate hanno mostrato alti livelli di espressione di geni e proteine correlati alla differenziazione in ogni fase, come marcatori di endoderma SOX17 al terzo giorno, marcatore precursore epatico HNF4 alfa al giorno otto, AFP al giorno 14 e marcatore epatocitaro maturo ALB al giorno 18.

Gli HHC mostravano colorazione verde e ampia colorazione dello spostamento dell'acido citoplasmatico. Gli epatociti mostravano una tipica morfologia bi-nucleata. L'attività enzimatica di CYP3A4, il CYP metabolico essenziale nel fegato negli HHC, è stata confermata con un saggio enzimatico.

L'applicazione di cellule staminali embrionali umane ad una densità appropriata e la differenziazione iniziale alla data successiva sono fondamentali. Nella prima fase, toccare delicatamente il supporto perché le cellule sono inclini a galleggiare verso l'alto. La combinazione di attivina A e altre piccole molecole può migliorare ulteriormente l'efficienza di differenziazione e produrre cellule simili a epatociti più mature in questa procedura.

Questa tecnica può fornire una piattaforma per esplorare il trapianto di epatociti, l'ingegneria dei tessuti epatici, i fegati bioartificiali e la modellazione delle malattie.