Name: Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri come valutare la tossicità di radiazioni UV e sostanze chimiche su cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate. Questo metodo in vitro riduce i test su animali per la sicurezza dei prodotti oftalmici.

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Gli autori non hanno ricevuto alcun finanziamento per questo lavoro.

1. Coltura di pHCEC e iHCEC
<ol><li>Coltivare i pHCEC e gli iHCEC nel mezzo epiteliale oculare umano (HOEM) con i seguenti integratori: 6 mM di L-glutammina, 0,002% di integratore di terreni cellulari O (Tabella dei materiali), 1,0 μM di epinefrina, 0,4% di integratore di terreni cellulari P (Tabella dei materiali), 5 μg/mL di insulina rh, 5 μg/mL di apo-transferrina e 100 ng/mL di idrocortisone emisuccinato in palloni rivestiti di collagene-1 (18 mL in un matraccio di coltura da 75 cm2 ).</li>
	<li>Cambiare il mezzo nei palloni ogni 2-3 giorni rimuovendo il mezzo dopo che le cellule crescono fino a ~ 80% di confluenza. Aggiungere la soluzione di dissociazione senza rosso fenolo e incubare il matraccio a 37 °C fino al completo distacco delle cellule. Neutralizzare la soluzione di dissociazione con DMEM/F12 con siero e quindi centrifugare le cellule a 500 × g. Rimuovere il mezzo surnatante e risospendere le cellule nel mezzo HOEM.</li>
</ol>2. Determinazione della dimensione della cellula mediante microscopia confocale
<ol><li>Seminare sia i pHCEC che gli iHCEC su piastre di Petri rivestite di collagene con vetrini di copertura a una concentrazione di 1 × 105 con 1 mL di HOEM. Coltivare pHCEC e iHCEC, un set di colture per 24 ore e un altro set di colture per 48 ore, in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo il periodo di incubazione, colorare le cellule con 500 μL di soluzione tampone colorante di annessina contenente calceina (4 μM), omodimero di etidio-1 (8 μM) e annessina V (5 μL in tampone da 500 μL-coniugato Alexa Fluor 647) per 20 minuti a 37 °C. Dopo aver colorato le cellule, regolare il microscopio per catturare le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488/515 nm per calcein-AM, 543/600 nm per l'omodimero-1 di etidio e 633/665 nm per l'annessina V utilizzando un microscopio a scansione laser confocale.</li>
	<li>Ottieni le immagini e prendi Z-stack per valutare le dimensioni delle celle in tre dimensioni.<ol><li>Per acquisire le immagini bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D), trovare l'area da visualizzare con un obiettivo d'acqua apocromato 40x/1.2. Con i laser Argon (488) (prima scansione), HeNe1 (543) (seconda scansione) e HeNe2 (633) (terza scansione), eseguire la scansione in tre canali separati utilizzando i beam splitter, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis e NFT 545 LP560, LP505.</li>
		<li>Utilizza la scansione sequenziale multitraccia per ridurre la diafonia. NOTA: LP505 viene utilizzato per il canale 2 con il laser 488 per catturare l'emissione del colorante calceina. LP560 viene utilizzato nel canale 3 con il laser 543 per catturare l'emissione dell'omodimero di etidio 1. NFT 635 viene utilizzato con il laser 633 per catturare l'emissione dell'annessina V. Lo scopo dell'HFT è quello di separare la luce di eccitazione e quella di emissione. NFT divide la luce riflettendo la luce < lunghezza d'onda specificata su un canale separato, lasciando che la luce > una lunghezza d'onda specificata attraverso un secondo canale. I filtri LP bloccano lunghezze d'onda più corte rispetto alla lunghezza d'onda specificata e lasciano passare le lunghezze d'onda più lunghe.</li>
		<li>Per visualizzare l'immagine in 3D, impostare la confocale su Z-stack e scansionare almeno 20 fotogrammi.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Esposizione delle cellule alle radiazioni UV
<ol><li>Seminare le cellule a 5 × 104/mL di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene-1 a 24 pozzetti e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 3 ore. Dopo il periodo di incubazione, ridurre il volume del mezzo nei pozzetti a 300 μL. Successivamente, esporre le cellule alle radiazioni UV (sia UVA a 6,48 W / m 2 che UVB a 1,82 W / m2 poiché entrambi i tubi UVA e UVB sono accesi nell'incubatore allo stesso tempo) in un incubatore a 37 ° C per 5 e 20 minuti in esperimenti separati.</li>
	<li>Dopo la radiazione UV, aggiungere 200 μL di HOEM fresco in ciascun pozzetto e incubare per 20 ore a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, raccogliere il surnatante cellulare in ciascun pozzetto e trasferirlo in tubi sterili di polipropilene da 2 ml. Congelare a -80 °C. Per determinare i livelli di citochine rilasciati dai pHCEC e iHCEC dopo l'esposizione ai raggi UV, utilizzare un test multiplex delle citochine e seguire le istruzioni del kit per quantificare le seguenti quattro citochine: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.</li>
	<li>Aggiungere il reagente del saggio metabolico alle cellule nei pozzetti.</li>
	<li>Preparare il reagente di dosaggio metabolico al 10% in DMEM/F12. Sostituire il terreno di coltura in ciascun pozzetto con 1 mL della soluzione di dosaggio metabolico al 10% e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 4 ore.</li>
	<li>Misurare la fluorescenza di ciascuna soluzione utilizzando un lettore di piastre fluorescenti a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 530/590 nm.</li>
</ol>4. Esposizione delle cellule a tossine chimiche
<ol><li>Cellule di seme a 5 × 104/mL di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene-1 a 24 pozzetti e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 3 ore. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il mezzo ed esporre le cellule a 1 ml di tossine chimiche (BAK 0,001%, H 2 O20,01% e SDS 0,0025% in soluzione salina tamponata fosfato (PBS)) per 5 e 15 minuti.</li>
	<li>Dopo l'esposizione alle tossine chimiche, rimuovere le tossine dai pozzetti, risciacquare con 1 mL di PBS e aggiungere 1 mL di HOEM a ciascun pozzetto. Dopo 20 ore di incubazione, eseguire un test metabolico sostituendo il terreno con 1 mL di una soluzione di dosaggio metabolico al 10% e incubando a 37 °C con CO 2 al 5% per 4 ore. Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre multipozzetto a fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 530/590 nm.</li>
	<li>Trasferire i surnatanti cellulari dai pozzetti dopo l'incubazione di 20 ore in provette sterili separate di polipropilene da 2 mL e congelare a -80 °C. Quantificare le citochine rilasciate dai pHCEC e dagli iHCEC dopo l'esposizione alle sostanze chimiche. Utilizzare la stessa piattaforma multiplex utilizzata per valutare le citochine dalle cellule trattate con raggi UV. Utilizzare un test di citochine multiplex seguendo le istruzioni del kit per quantificare le seguenti quattro citochine: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.</li>
</ol>5. Esame delle cellule esposte a varie concentrazioni di BAK
<ol><li>Le cellule seme a 1 × 10 5/mL di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene-1 a 24 pozzetti e incubano a 37 °C con il5% di CO2 per 24 ore. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il mezzo ed esporre le cellule a 1 ml di tossine chimiche (BAK 0,001%, BAK 0,005% e BAK 0,01% in PBS) per 5 minuti.</li>
	<li>Dopo l'esposizione, rimuovere le tossine chimiche, sciacquare i pozzetti con 1 ml di PBS e aggiungere 1 ml di HOEM a ciascun pozzetto. Dopo 20 ore di incubazione, colorare le cellule con 500 μL di soluzione tampone colorante di annessina contenente calceina (4 μM), omodimero-1 di etidio (8 μM) e annessina V (5 μL in tampone da 500 μL-coniugato Alexa Fluor 647) per 20 minuti a 37 °C. Regolare il microscopio per misurare le intensità della colorazione dell'annessina V, della calceina AM e dell'etidio-1 a lunghezze d'onda di eccitazione / emissione rispettivamente di 630/675 nm, 495/515 nm e 528/617 nm. Immagini delle cellule usando il microscopio a fluorescenza</li>
</ol>6. Analisi dei dati
<ol><li>Eseguire un test di normalità e un test per varianze uguali prima di eseguire un'analisi della varianza (ANOVA), Welch ANOVA o Kruskal-Wallis. Utilizzare il test post-hoc appropriato per confrontare ciascun gruppo testato. Impostare p < 0.05.</li>
</ol>

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</ol>

L'autore, Lyndon W. Jones, negli ultimi 3 anni, attraverso CORE, ha ricevuto supporto alla ricerca o onorari di conferenze dalle seguenti società: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J & J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage e Visioneering. Lyndon Jones è anche consulente e/o fa parte di un comitato consultivo per Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis e Ophtecs. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Sono state valutate le potenziali differenze nell'uso di due tipi di HCEC. Le cellule sono state collocate nello stesso mezzo (HOEM) a concentrazioni identiche di cellule e quindi esposte a brevi e lunghi periodi di radiazioni UV e tre tossine oculari. Le dosi di radiazioni UV e sostanze chimiche sono state selezionate in base ai loro effetti fisiologici, che erano abbastanza dannosi per le cellule da produrre risposte intermedie che potevano essere confrontate. I tempi di esposizione di 5 e 20 minuti per le radiazioni U...

Gli studi tossicologici in vitro vengono eseguiti per prevedere gli effetti tossici di sostanze chimiche e altri agenti che possono causare danni alle cellule. Nella valutazione della tossicità per la cornea, le cellule epiteliali corneali umane (HCEC) sono state utilizzate in modelli per valutare questi effetti 1,2,3,4. Questi modelli valutano tipicamente gli effetti fisiologici come i cambiamenti nell'attività metabolica della cellula, la proliferazione cellulare e altre funzioni cellulari come la produzione e il rilascio di citochine infiammatorie. Per questi studi tossicologici, sono state selezionate cellule provenienti da varie fonti per valutare gli effetti dannosi delle sostanze chimiche e delle radiazioni UV sugli HCEC 2,3. Le linee pHCEC sono disponibili presso aziende che forniscono queste cellule da tessuti donatori di adulti. Le cellule primarie possono essere trattate con dispase e raschiate delicatamente dalla cornea per la coltura5. Le cellule vengono quindi testate per virus e contaminazione e quindi spedite crioconservate in dimetilsolfossido al 10%.
Il vantaggio delle linee cellulari primarie è che le cellule sono geneticamente identiche alle cellule del donatore. Questo è l'ideale, poiché un modello in vitro dovrebbe imitare il tessuto in vivo il più possibile. Lo svantaggio delle linee cellulari primarie è che hanno un numero limitato di divisioni o passaggi cellulari6. Il numero limitato di cellule disponibili limita il numero di esperimenti che possono essere condotti con una singola coltura primaria, aumentando il costo degli esperimenti.
Linee cellulari immortalizzate sono state utilizzate anche in modelli di tossicità per colture cellulari. Tuttavia, a differenza della linea cellulare primaria ottenuta da tessuto in vivo, la linea cellulare immortalizzata è stata geneticamente modificata. Le cellule immortalizzate sono create incorporando i geni di un virus nel DNA delle cellule primarie 6,7,8. Le cellule con incorporazione genica virale di successo sono selezionate per la linea cellulare immortalata. Il vantaggio dell'immortalizzazione è che consente una rapida proliferazione indefinita, fornendo un numero illimitato di cellule per eseguire più esperimenti utilizzando la stessa linea cellulare. Ciò consente la coerenza tra gli esperimenti e riduce i costi.
Oltre ai cambiamenti nei geni che limitano la proliferazione cellulare, potrebbero verificarsi anche cambiamenti nell'espressione di geni di funzionalità critica9. Pertanto, lo svantaggio di utilizzare cellule immortalizzate è che potrebbero non rappresentare più le cellule originali in vivo in termini di risposta a vari stimoli esterni10. I confronti hanno comportato l'osservazione degli effetti tossici delle sostanze chimiche sui cheratociti corneali umani primari e immortalizzati11, nonché sugli HCEC immortalizzati e sulle cellule primarie epiteliali corneali di coniglio12. Il confronto tra gli effetti delle tossine sui cheratociti umani primari e sui cheratociti immortalizzati non ha mostrato differenze significative11. Utilizzando i metodi descritti in questo articolo, verrà determinata l'efficacia di questi test per valutare la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine oculari su pHCEC e iHCEC.
Sono state selezionate tre tossine oculari comunemente utilizzate nei saggi in vitro: BAK,H 2 O2 e SDS. Il BAK è un conservante cationico comunemente usato nelle soluzioni oftalmiche 13,14, H 2O2 è comunemente usato per disinfettare le lenti a contatto 15 e SDS è un tensioattivo anionico presente in detergenti e shampoo 14. Analogamente alle tossine oculari, le radiazioni UV possono anche causare danni significativi agli HCEC3. Inoltre, la sovraesposizione ai raggi UV può causare una condizione oculare nota come fotocheratite caratterizzata da sintomi di lacrimazione, sensibilità alla luce e sensazione di granulosità16.
C'è un numero illimitato di colture cellulari primarie che possono essere utilizzate e varie linee cellulari immortalizzate che sono state sviluppate. Pertanto, è stata intrapresa un'indagine per confrontare gli HCEC primari con una linea HCEC immortalata per determinare somiglianze e differenze tra i modelli che incorporano questi tipi di cellule.
Questa indagine ha utilizzato la microscopia per valutare le possibili differenze tra pHCEC e iHCEC sulla risposta fisiologica delle cellule ai raggi UV e alle tossine. Sono stati valutati anche gli effetti delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sull'attività metabolica cellulare e sul rilascio di citochine infiammatorie per le due linee cellulari. L'importanza di determinare le differenze tra le due linee cellulari è comprendere l'uso ottimale di queste linee cellulari per valutare: 1) l'effetto delle radiazioni UV sulle cellule, 2) gli effetti delle tossine sulle cellule e 3) i cambiamenti risultanti al metabolismo, alla vitalità cellulare e al rilascio di citochine cellulari per studi futuri.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 Flacone ventilato</td><td>Corning</td><td>354485</td><td>Questa è la piastra</td></tr> a <tr><td>96 pozzetti</td> rivestita di collagene del marchio BioCoat <td>costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Annexin Soluzione tampone colorante</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert 100 con microscopio a scansione laser confocale Zeiss 510 sistema</td><td>Carl Zeiss Inc., Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Piastre a 48 pozzetti</td><td>Corning</td><td>354505</td><td>Questo è il marchio BioCoat, rivestito di collagene</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>Può leggere la fluorescenza da 280 a 700 nm (per il test 540/590)</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hycone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti con fondo in vetro</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule epiteliali corneali umane umane</td><td>dell'Università di Ottawa</td><td>N/A</td><td>SV40-immortalizzate cellule epiteliali corneali umane dal Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) e sono state caratterizzate Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Equivalenti corneali umani funzionali costruiti da linee cellulari. Scienza. 1999;286:2169-72.</td></tr><tr><td>Epiteli Oculari Umani Terreni Metallici (HOEM) con i seguenti integratori:</td> <td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCMC001</td><td>Epigro terreni base integrati con 6 mM di L-Glutammina, 0,002% EpiFactor O (supplemento di terreni cellulari O nell'articolo), 1,0 &mu; M Epinefrina, 0,4% EpiFattore P (integratore di terreni cellulari P nell'articolo), 5 &mu; g/mL rh Insulina, 5 &mu; g/mL di Apo-Transferrina e 100 ng/mL di idrocortisone emisuccinato in fiasche di coltura rivestite di Collagene-1 (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td></tr><tr><td>Vivo Morto di calcine ed etidio omodimero</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 strumento</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD Pannello proinfiammatorio umano II (4-Plex) Saggio V-Plex</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Concentrazione 100x, quindi aggiungere 1 mL a ogni 99 mL di terreno</td></tr><tr><td>Cellule epiteliali corneali primarie</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCCE016</td> Lettore di piastre a fluorescenza a più pozzetti SpectraMax <td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (soluzione di dissociazione cellulare)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione della tossicità delle radiazioni uv e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Questo articolo descrive i metodi per misurare la tossicità delle radiazioni ultraviolette (UV) e delle tossine oculari su colture di cellule epiteliali corneali umane primarie (pHCEC) e immortalizzate (iHCEC). Le cellule sono state esposte a radiazioni UV e dosi tossiche di benzalconio cloruro (BAK), perossido di idrogeno(H 2 O2) e sodio dodecilsolfato (SDS). L'attività metabolica è stata misurata utilizzando un test metabolico. Il rilascio di citochine infiammatorie è stato misurato utilizzando un test multi-plex di interleuchina (IL)-1β, IL-6, IL-8 e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e le cellule sono state valutate per la vitalità utilizzando coloranti fluorescenti.
Gli effetti dannosi dei raggi UV sull'attività metabolica cellulare e sul rilascio di citochine si sono verificati a 5 minuti di esposizione ai raggi UV per iHCEC e 20 minuti per pHCEC. Simili cali percentuali nell'attività metabolica di iHCEC e pHCEC si sono verificati dopo l'esposizione a BAK, H 2 O2o SDS e i cambiamenti più significativi nel rilascio di citochine si sono verificati per IL-6 e IL-8. La microscopia delle cellule esposte a iHCEC e pHCEC BAK colorate con fluorescenza ha mostrato la morte cellulare con un'esposizione BAK dello 0,005%, sebbene il grado di colorazione dell'etidio fosse maggiore negli iHCEC rispetto ai pHCEC. Utilizzando molteplici metodi di valutazione degli effetti tossici mediante microscopia, valutazioni dell'attività metabolica e produzione di citochine, la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche potrebbe essere determinata sia per le linee cellulari primarie che per quelle immortalate.

Dimensioni della cella Gli HCEC primari e immortalati sono stati visualizzati con tre coloranti fluorescenti, che riflettono tre diversi stadi di vitalità cellulare. Le cellule vive sono verdi (calceina-AM), le cellule morte sono rosse (omodimero di etidio-1) e le cellule apoptotiche sono gialle (colore regolato dal computer V-annessina per una migliore visualizzazione del segnale di fluorescenza). Le cellule vive contengono esterasi nel citoplasma cellulare e convertono calcein-AM in calceina. Le cel...

Questo articolo descrive le procedure utilizzate per valutare la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche su una linea cellulare primaria e immortalata.

Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Questo metodo può essere utilizzato per valutare in vitro la tossicità di nuove formulazioni di prodotti oftalmici. Affinando le concentrazioni di sostanze chimiche e formulazioni di prodotti utilizzando cellule oculari in vitro, l'uso di animali per valutare la sicurezza di nuovi prodotti può essere ridotto al minimo. I saggi in vitro valutano gli endpoint di tossicità che non possono essere valutati in vivo, come la determinazione dell'effetto di una sostanza chimica sulla funzione mitocondriale, sull'integrità della membrana cellulare e sull'attività enzimatica.Valutare la tossicità cellulare in vitro è la chiave per comprendere i potenziali meccanismi di tossicità. Questo è essenziale per stabilire una dose massima tollerabile di sostanze chimiche terapeutiche nell'occhio. A dimostrare la procedura sarà Nijani Nagaarudkumaran, un ricercatore del Jones Laboratory.Inizia posizionando sia i pHCEC che gli iHCEC su piastre di Petri rivestite di collagene con coperchio inferiore in vetro scivola a una concentrazione di 1 x 10 al 5 ° con 1 millilitro di mezzo epitelio oculare umano o HOEM. Coltiva pHCEC e iHCEC 1 set di colture per 24 ore e un altro set per 48 ore in un incubatore a 3

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Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate (Video) | JoVE Journal

Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate

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