Name: Crescita, purificazione e titolazione del virus Oncolytic Herpes Simplex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Impara a coltivare, purificare e titolare l'herpes simplex virus oncolitico per studi preclinici in immunoterapia antitumorale. Questo protocollo semplice garantisce stock virali di alta qualità in laboratorio di biosicurezza livello due.

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La ricerca nel laboratorio saha è stata supportata in parte da fondi del DIPARTIMENTO (W81XWH-20-1-0702) e della Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin e Melissa R.M. Humphrey erano parzialmente supportati da NIH (R01 CA160762).

1) crescita oHSV
NOTA: Garantire l'approvazione del comitato istituzionale per la biosicurezza prima di lavorare con oHSV. Questo studio è stato condotto nell'ambito del protocollo IBC n. 18007 approvato. Mantenere le precauzioni BSL2: sbiancare tutte le pipette, le punte, i tubi e altri materiali che entrano in contatto con il virus. Spruzzare guanti con 70% di alcol isopropile prima che le mani lascino il cappuccio di coltura cellulare BSL2. Lavarsi sempre accuratamente le mani con acqua di sapone dopo aver lavorato con un virus.
<ol><li>Il giorno -1, semina cellule Vero a basso passaggio in 20 T-150 cm2 fiasche ad una densità di 7-8 × 106 cellule / pallone nel normale mezzo cellulare Vero. NOTA: Vero medium viene preparato integrando il mezzo aquila modificato (DMEM) di Dulbecco con siero di vitello fetale inattivato al 10% (IFCS).</li>
	<li>Il giorno 0 (le cellule sono confluenti all'80-90% ), aggiungere l'inoculo oHSV sulle cellule di Vero.<ol>
<li>Preparazione dell'inoculo del virus<ol>
<li>Utilizzare una molteplicità di infezione (MOI) di 0,01 (MOI può variare da 0,01 a 0,1 a seconda della capacità di replicazione del virus) per l'amplificazione del virus. Utilizzare la formula (1) per calcolare la quantità di virus (mL) per 20 contenitori. Quantità di virus (mL) per 20 fiasche = quantità di virus necessaria (pfu)/titolo di stock virale (pfu/mL)(1)</li>
			<li>Utilizzare la salina tamponata con fosfato (DPBS) ad alto glucosio di Dulbecco integrata con 1% di IFCS per preparare l'inoculo del virus (7 ml per pallone T-150 cm2, cioè ~ 140 mL per 20 mambi). Aggiungere la quantità richiesta di oHSV a 140 mL di soluzione IFCS ad alto glucosio DPBS/1%, vortice per 1 minuto e mantenere la miscela pronta per l'aggiunta alle cellule Vero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lavare il T-150 cm2 fiasche 2x con DPBS ad alto glucosio integrato con 1% IFCS (10 mL/ lavaggio). Aspirare il DPBS/1% IFCS e aggiungere 7 ml di inoculo virale/T-150 cm2 pallone.</li>
		<li>Dondolare delicatamente i mazzi per 5 minuti utilizzando un rocker per la corretta distribuzione dell'inoculo sul monostrato Vero, quindi incubare i contenitori a 37 °C per 1,5-2 ore. Assicurarsi che lo scaffale dell'incubatore sia livellato.</li>
		<li>Rimuovere l'inoculo e aggiungere DMEM integrato con 1% IFCS (25 mL/pallone). Incubare i contenitori per 2-4 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Controllare quotidianamente i contenitori per il 90-100% di CPE (vedere figura 2).</li>
	<li>Raccogli le cellule Vero infettate da oHSV.<ol>
<li>Raccogliere il supernatante di coltura (~20 mL) da ogni pallone (lasciare ~5 mL in ogni pallone) in tubi di centrifuga conica da 50 ml o contenitore di supporti.</li>
		<li>Utilizzare un raschietto per celle per raschiare delicatamente le cellule dal fondo dei contenitori. NOTA: Le cellule dovrebbero uscire rapidamente dai contenitori.</li>
		<li>Aggiungere ~15 mL del supernatante di coltura (raccolto nel passaggio 1.4.1) a ciascun pallone (che porta il volume di ~ 20 mL in ogni pallone, cioè 400 mL per 20 fiasche) e lavare delicatamente il fondo dei mazzi di lino alcune volte utilizzando un tubo sierologico sterile da 10 ml. NOTA: Non pipet vigorosamente. Cerca di mantenere intatte tutte le cellule.</li>
		<li>Raccogliere le cellule (+ mezzo) in tubi di centrifuga conica da 50 ml su ghiaccio (utilizzare 8 tubi per contenere 400 ml di cellule raccolte da 20 contenitori).</li>
		<li>Ruotare le cellule a 300 g per 10 min a 4 °C e aspirare il supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 1,25 mL (50%) di Virus Buffer (VB) e 1,25 mL (50%) di coltura supernatante (raccolto nel passaggio 1.4.1) ad ogni tubo di centrifuga e sospendere accuratamente ogni pellet. Trasferire le celle risostillate da otto tubi di centrifuga da 50 ml a un tubo di centrifuga conica da 50 ml. NOTA: fare riferimento alla preparazione della soluzione VB nella tabella 1. Sterilizzare il filtro della soluzione VB utilizzando un filtro di sterilizzazione multimediale. Utilizzare 0,5 ml di VB + 0,5 mL di supernatante per pallone T-150 cm2 per la nuova sospensione, cioè per 20 mambi (20 mL), utilizzare 10 ml di VB e 10 ml di supernatante di coltura.</li>
		<li>Congelare le cellule ri-sospese utilizzando ghiaccio secco / 100% etanolo e conservare a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2) purificazione oHSV
<ol><li>Snap-freeze (nel ghiaccio secco e 100% di etanolo)/scongelamento (in un bagno d'acqua calda a 37 °C) le cellule seguite da bagno d'acqua-sonicazione per 1 minuto per un totale di 3 cicli per garantire una corretta lisi delle cellule per rilasciare virus nel supernatante. NOTA: Eseguire la sonicazione per 1 minuto utilizzando 40 kHz, 120 V di potenza. Se non è disponibile un sonicatore tonnibile, utilizzare un sonicatore ad ultrasuoni per il bagno d'acqua. Prendere un'aliquota di 50 μL per la titolazione nella sezione 3, che aiuterà a identificare quale delle seguenti misure è responsabile di una potenziale perdita di virus durante la procedura di purificazione.</li>
	<li>Trattare il lisato cellulare con Benzonasi Nucleasi (175 unità/mL) + 2 mM MgCl2 (1 M stock = 2 μL/mL), vortice e incubare per 30 min a 37 °C. Posizionare il tubo sul ghiaccio ed eseguire i seguenti passaggi a 4 °C.</li>
	<li>Pellettizzazione dei detriti cellulari mediante centrifugazione a bassa velocità.<ol>
<li>Ruotare il lysate cellulare a 300 g per 10 min.</li>
		<li>Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (sospendere di nuovo il pellet di cella in 0,5 ml di VB, designarlo come pellet-1 e conservare a 4 °C per l'uso nella fase 2.3.5; vedere figura 1).</li>
		<li>Ruotare nuovamente il supernatante (ottenuto nel passaggio 2.3.2) a 500 g per 10 min.</li>
		<li>Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (sospendere di nuovo il pellet di cella in 0,5 ml di VB, designarlo come pellet-2 e conservare a 4 °C per l'uso nella fase 2.3.5; vedere figura 1).</li>
		<li>Unire il pellet-1 ri-sospeso (da 2.3.2) e pellet-2 (da 2.3.4) in un nuovo tubo di centrifuga da 1,7 ml, vortice / sonicato (bagno d'acqua) 2x e girare a 400 g per 10 minuti. Raccogliere il supernatante e combinarlo con il supernatante ottenuto al passaggio 2.3.4; cfr. figura 1). NOTA: Eseguire la sonicazione per 1 minuto utilizzando 40 kHz, potenza di 120 V per prevenire l'aggregazione virale prima della procedura di filtrazione nel passaggio 2.4. Prendere un'aliquota di 50 μL del supernatante combinato per la titolazione nella sezione 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrare il supernatante combinato (~21 mL, cioè 20 mL da 1.4.6, 0.5 mL da 2.3.2 e 0.5 mL da 2.3.4) utilizzando il seguente metodo di filtrazione in 3 passaggi.<ol>
<li>Esegnare 21 ml del supernatante utilizzando una siringa da 10 ml (5-7 ml ogni volta per un facile passaggio attraverso il filtro) e passarlo attraverso un filtro sterile a membrana in polivinilidene da 5 μm (PVDF) posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (etichettato come TUBE 1).<ol>
<li>Aggiungere 1 ml di VB a un tubo di centrifuga conico da 50 mL svuotato in 2.4.1 (per raccogliere la quantità residua di supernatante virus), vortice, e passare attraverso lo stesso filtro PVDF da 5 μm posto su TUBE 1 (portando il totale a 22 ml di filtrato). Procedere al passaggio 2.4.2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Estraere 22 ml del filtrato da TUBE 1 (come in 2.4.1) e passarlo attraverso un filtro sterile a membrana in cellulosa mista (MCE) da 0,8 μm posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml (etichettato come TUBE 2).<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di VB a TUBE 1 svuotato nel passaggio 2.4.2, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro MCE da 0,8 μm posto su TUBE 2 (portando il totale a 23 ml di filtrato). Procedere al passaggio 2.4.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Esegnare 23 ml di filtrato da TUBE 2 (come in 2.4.1) e passarlo attraverso un filtro PVDF sterile da 0,45 μm posto su un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 mL (etichettato come TUBE 3).<ol>
<li>Aggiungere 1 ml di VB a TUBE 2 svuotato nel passaggio 2.4.3, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro PVDF da 0,45 μm posto su TUBE 3 (portando il totale a 24 ml di filtrato). NOTA: Prendere un'aliquota di 50 μL del filtrato per la titolazione nella sezione 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugazione ad alta velocità con il metodo del gradiente di saccarosio NOTA: In questo protocollo è stato utilizzato un rotore ad angolo fisso F13-14x50cy. Sia il rotore che la centrifuga devono essere a 4 °C prima di procedere con i seguenti passaggi.<ol>
<li>Aggiungere 10 ml di una soluzione di saccarosio al 25% ghiacciata e filtrata sterile (preparata sciogliendo 25 g di polvere di saccarosio in 100 ml di soluzione salina bilanciata di Hank) in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 ml.</li>
		<li>Lentamente (3 mL/min) aggiungere 24 mL del filtrato virale (ottenuto dal gradino 2.4.3.1) sopra lo strato di saccarosio. Fare attenzione a mantenere strati separati del filtrato del virus e della soluzione di saccarosio. NOTA: Fino a 30 mL dello strato virale possono essere aggiunti oltre 10 mL della soluzione di saccarosio.</li>
		<li>Centrifugare il tubo per 90 min a 22.620 g a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e lo strato di saccarosio dal tubo di centrifuga conica da 50 ml. NOTA: Il pellet del virus deve essere biancastro. Prendere un'aliquota di 50 μL del supernatante e un'aliquota di 50 μL dello strato di saccarosio per la titolazione nella sezione 3.</li>
	</ol></li>
	<li>Sospendere di nuovo il pellet in soluzione di glicerolo/PBS al 10%.<ol>
<li>Aggiungere 1 ml di glicerolo sterile al 10% (diluito in PBS) al tubo di centrifuga conica da 50 ml per coprire il pellet. NOTA: La quantità della miscela ri-sospesa può variare (come 0,8-1,2 mL) a seconda delle dimensioni del pellet. Un volume minore darebbe una maggiore concentrazione di virus.</li>
		<li>Posizionare il tubo di centrifuga conica da 50 ml sul ghiaccio per 2-4 ore. Durante questo periodo, sonicare /vortice il pellet ogni 15 minuti per 30 s per aiutare a spodestare / sospendere il pellet.</li>
		<li>Raccogliere il pellet ri-sospeso (1 ml di glicerolo/PBS + la dimensione del pellet porterà il volume totale a ~ 1,3 ml) in un tubo di microcentrifugo da 2 ml. [Facoltativo: aggiungere altri 0,3 ml di glicerolo/PBS al 10% di glicerolo/PBS allo stesso tubo di centrifuga conico da 50 mL per raccogliere la quantità di traccia rimanente del pellet, pipetta su e giù e combinare con il pellet ri-sospeso nel passaggio 2.6.3 per portare il volume totale a ~1,6 mL.]<ol>
<li>Se la sospensione nel passaggio 2.6.3 è torbida o torbida (a causa di detriti cellulari), centrifugare il tubo a 500 g per 10 minuti, trasferire il supernatante su un nuovo tubo di microcentrifugo da 2 ml e procedere al passaggio 2.6.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prendere un'aliquota di 50 μL per la titolazione oHSV nella sezione 3. Aliquotare il resto della soluzione (250 μL/aliquota) in tubi sterili a microcentrifugo con tappi a vite (ben sigillati per lo stoccaggio a lungo termine), congelare a scatto e conservare a -80 °C fino all'uso (pronto per studi sperimentali una volta determinato il titolo oHSV). NOTA: Tutti i materiali che entrano in contatto con il virus devono essere sbiancati o trattati con radiazioni ultraviolette prima di essere rimosso dalla cappa o dallo smaltimento.</li>
	</ol></li>
</ol>3. titolazione oHSV e dosaggio della placca
<ol><li>Seme 1,7-1,8 x 105 cellule Vero/pozzo in una piastra di coltura cellulare a 6 porri nel mezzo cellulare Vero (DMEM con 10% IFCS; vedere fase 1.1). NOTA: Assicurarsi che le cellule siano distribuite in modo omogeneo in tutto il pozzo; non ruotare la piastra, che può causare accumulo di cellule nel mezzo dei pozzi. Per evitare vorticosi, scuotere lentamente la piastra a mano verticalmente, quindi orizzontalmente, quindi posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore.</li>
	<li>Il giorno successivo (quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza), aspirano il mezzo di coltura e aggiungono 1 mL / pozzo di PBS ad alto glucosio integrato con 1% IFCS. Lasciare la piastra nella cappa di coltura cellulare fino al completamento del passaggio 3.3.</li>
	<li>Diluire serialmente il virus in tubi in polipropilene da 5 ml utilizzando PBS/1% IFCS (Figura 3). NOTA: Utilizzare l'aliquota di 50 μL raccolta nel passaggio 2.6.4 per la diluizione seriale. Nel tubo 1st (diluizione10-3), aggiungere 2 μL del virus nel 1998 μL di PBS/1%IFCS, vortice. Nel secondo tubo(diluizione 10-5), prendere 10 μL dal tubo 1st in 990 μL di PBS/1% IFCS, vortice. Nel tubo 3rd (10-6 diluizione), prendere 100 μL dal 2° tubo in 900 μL di PBS/1% IFCS, vortice; continuare questa diluizione seriale di 10 volte fino alladiluizione 10-9. Vedere i dettagli nella figura 3.</li>
	<li>Aspirare PBS/1% IFCS e aggiungere 0,7 mL/pozza del virus diluito serialmente (a partire da 10-5 a 10-9) alle cellule Vero. NOTA: Non lasciare asciugare le cellule.</li>
	<li>Dondolare delicatamente la piastra su un rocker per 5 minuti a temperatura ambiente (per garantire una distribuzione omogenea dell'inoculo del virus).</li>
	<li>Incubare la piastra per 1,5 ore a 37 °C. NOTA: Durante questo periodo di incubazione, preparare la diluizione 1:1000 dell'immunoglobulina umana G (IgG) in DMEM integrata con 1% IFCS. Per una piastra a 6 po porsi, preparare 12,5 mL in modo che 2 mL / pozzo possano essere utilizzati nel passaggio 3.7. Regolare la diluizione per tenere conto delle variazioni di lotto nell'IgG umano.</li>
	<li>Rimuovere l'inoculo virale dai pozzi e aggiungere 2 mL/pozzo dello 0,1% di IgG umano (per neutralizzare l'oHSV nel terreno di coltura e prevenire la formazione di placche secondarie) in DMEM integrato con 1% IFCS. Incubare la piastra a 37 °C per 3-4 giorni. NOTA: Le placche chiare di solito si formano in 3 giorni.</li>
	<li>Piastre di fissaggio e colorazione<ol>
<li>Rimuovere il supernatante e fissare le cellule in metanolo puro (1 mL / pozzo) per 5 minuti. Rimuovere il metanolo e lasciare asciugare le piastre all'aria.</li>
		<li>Diluire la macchia di Giemsa (1:5) con acqua deionizzata e aggiungere 1 mL della macchia diluita di Giemsa per pozzo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10-15 minuti.</li>
		<li>Rimuovere la macchia, risciacquare con acqua del rubinetto e lasciare asciugare all'aria le piastre.</li>
		<li>Contare le placche usando un microscopio sezionato.</li>
		<li>Facoltativo per oHSV con espressione lacZ:<ol>
<li>Rimuovere il supernatante e fissare le cellule con glutaraldeide fredda dello 0,2% /2% di paraformaldeide per 5-10 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Rimuovere la soluzione fissante e lavare le celle 3 volte con PBS.</li>
			<li>Aggiungere la soluzione X-gal alle cellule (1 mL/pozzo) e incubare la piastra a 37 °C per 2 ore. NOTA: La macchia X-gal deve essere preparata appena il giorno della colorazione; conservazione a lungo termine potrebbe portare allo sbiadimento del colore. Vedere la preparazione della soluzione X-gal nella tabella 1.</li>
			<li>Rimuovere la macchia X-gal e lavare la piastra con acqua del rubinetto per 1 minuto.</li>
			<li>Contro-macchia con soluzione Neutra Rossa (1 mL/pozzo) per 2 min a temperatura ambiente. NOTA: Vedere preparazione della soluzione rossa neutra nella tabella 1.</li>
			<li>Lavare il piatto con acqua del rubinetto per 1 minuto; lasciare asciugare le piastre all'aria.</li>
			<li>Contare le placche blu utilizzando un microscopio sezionato (Figura 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Calcolare il carattere utilizzando la formula (2) Timone in pfu/mL (unità di formatura della placca) = Numero di placche/0,7 mL × fattore di diluizione (2) NOTA: Ad esempio, se 25 placche si trovano nel pozzo didiluizione 10 -9, il titolo è 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/mL. Questo è il giacimento finale di aliquote oHSV preparato nella fase 2.6.4.</li>
</ol>

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</ol>

SDR è co-inventore di brevetti relativi a virus simplex dell'herpes oncolytic, di proprietà e gestito dalla Georgetown University e dal Massachusetts General Hospital, che hanno ricevuto royalties da Amgen e ActiVec Inc. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo inizia con la crescita di oHSV nelle cellule vero a basso passaggio. La confluenza del monostrato a cellule Vero dovrebbe essere ~80% al momento dell'inoculazione del virus in quanto le cellule invase possono sviluppare strutture fibrose strette che possono ridurre l'ingresso di oHSV nelle cellule Vero20. Una volta osservato il 90-100% cpe, il supernatante della coltura viene rimosso, le cellule vengono raccolte, rimescolate in VB /supernatante (vedi passaggio 1.4.6), congelate a sca...

I virus oncolitici (UV) sono una forma emergente e unica di immunoterapia oncologica. I televisori replicano selettivamente nelle cellule tumorali e lenalisi (risparmiando cellule normali / sane)1 mentre inducono l'immunità antitumorale2. Il virus dell'herpes simplex oncolitico (oHSV) è uno dei virus più studiati tra tutti gli UV. È più lontano lungo la clinica, con Talimogene laherparepvec (T-VEC) che è il primo e unico OV a ricevere l'approvazione della FDA negli Stati Uniti per il trattamento del melanoma avanzato3. Oltre al T-VEC, molti altri OHSV geneticamente modificati sono in fase di test preclinicamente e clinicamente in diversi tipidi cancro 3,4,5,6,7,8. L'attuale biotecnologia avanzata del DNA ricombinante ha ulteriormente aumentato la fattibilità dell'ingegneria di nuovi oHSV codificanti per transgeni terapeutici3,5. Un efficiente sistema di propagazione, purificazione e determinazione del tintore oHSV è fondamentale prima che qualsiasi oHSV (di nuova sviluppo) possa essere testato per studi in vitro e in vivo. Questo documento descrive un semplice metodo passo-passo di crescita oHSV (nelle cellule vero), purificazione (con il metodo del gradiente di saccarosio) e titolazione (mediante un saggio di placca oHSV nelle cellule Vero)(Figura 1). Può essere facilmente adottato in qualsiasi ambiente di laboratorio biosicurezza di livello 2 (BSL2) per ottenere uno stock virale di alta qualità per studi preclinici.
Vero, una linea di cellule renali di scimmia verde africana, è la linea cellulare più comunemente usata per la propagazione oHSV9,10,11,12,13 poiché le cellule vero hanno una via di segnalazione dell'interferone antiviraledifettosa 14. Altre linee cellulari con stimolatore inattivato di geni interferoni (STING) possono essere utilizzate anche per la crescita oHSV12,13. Questo protocollo utilizza cellule Vero per la crescita oHSV e il test della placca. Dopo la propagazione, le cellule infettate da oHSV vengono raccolte, lisciviate e sottoposte a purificazione, in cui le cellule lisciviate vengono prima trattate con nucleasi benzonasi per degradare il DNA delle cellule ospiti, prevenire l'aggregazione acido-proteina nucleica e ridurre la viscosità del lisato cellulare. Poiché la corretta attivazione della benzonasi richiede spesso Mg2+,in questo protocollo 15 viene utilizzato1-2 mM MgCl2. I detriti delle cellule ospiti del llysato cellulare trattato con benzonasio vengono ulteriormente eliminati mediante filtrazione seriale prima della centrifugazione ad alta velocità del gradiente di saccarosio. Un cuscino viscoso per la soluzione di saccarosio al 25% aiuta a garantire un tasso più lento di migrazione del virus attraverso lo strato di saccarosio, lasciando componenti correlati alle cellule ospiti nel supernatante, migliorando così la purificazione e limitando la perdita di virus nel pellet16. L'oHSV purificato viene quindi titolato sulle cellule Vero e le placche virali vengono visualizzate da Giemsa chemacchia 17 o colorazione X-gal (per la codifica LacZ oHSV)18.

<table><tbody><tr><td>Provette da centrifuga da 1,7 mL</td><td>Provette da centrifuga Sigma</td><td>CLS3620</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Provette da centrifuga in polipropilene</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Provette da centrifuga</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mL in polipropilene</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase Raschietto cellulare Nuclease</td><td>Sigma</td><td>E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Modificato Medio</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma</td><td>G3032</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Corning</td><td>MT-21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' ad alto contenuto di glucosio s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma</td><td>D4031</td><td></td></tr><tr><td>Immunoglobulina umana</td><td>Gamastan</td><td>NDC 13533-335-12</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di sterilizzazione, 250 mL</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di sterilizzazione per terreni, 500 mL</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25C</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Rossa Neutra</td><td>Sigma</td><td>N4638</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Fisher scientific</td><td>&nbsp; 15710S</td><td></td></tr><tr><td>Bilanciere a piastre</td><td>Fisher</td><td>88861043</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall ST 16R</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 21R Centrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002446</td><td></td></tr><tr><td>Provette sterili per microcentrifuga con tappo a vite</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-371</td><td></td></tr> Filtro per siringa Fisher <tr><td>Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td>in<td>saccarosio</td></tr><tr><td>, 0,45 PVDF</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>filtro per siringa, 0,8 MCE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLAA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa, 5 & micro; m PVDF</td><td>MilliporePallone di coltura Sigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>T150</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>816116</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua ad ultrasuoni</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Corning</td><td>46-101-RF</td><td></td></tr></tbody></table>

crescita, purificazione e titolazione del virus oncolytic herpes simplex

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

I virus oncolitici (OV), come il virus dell'herpes simplex oncolitico (oHSV), sono una strategia di trattamento in rapida crescita nel campo dell'immunoterapia oncologica. Gli OV, incluso l'oHSV, replicano selettivamente e uccidono le cellule tumorali (risparmiando cellule sane / normali) mentre inducono l'immunità antitumorale. A causa di queste proprietà uniche, le strategie di trattamento basate su oHSV sono sempre più utilizzate per il trattamento del cancro, preclinicamente e clinicamente, incluso il talimogene laherparevec (T-Vec) approvato dalla FDA. La crescita, la purificazione e la titolazione sono tre tecniche di laboratorio essenziali per qualsiasi VS, compresi gli OHSV, prima che possano essere utilizzati per studi sperimentali. In questo articolo viene descritto un semplice metodo passo-passo per amplificare l'oHSV nelle celle Vero. Man mano che gli oHSV si moltiplicano, producono un effetto citopatico (CPE) nelle cellule di Vero. Una volta che il 90-100% delle cellule infette mostra un CPE, vengono raccolte delicatamente, trattate con benzonasi e cloruro di magnesio (MgCl2),filtrate e sottoposte a purificazione utilizzando il metodo del gradiente di saccarosio. Dopo la purificazione, il numero di oHSV infettivi (designati come unità di formatura della placca o PFU) è determinato da un "saggio di placca" nelle cellule di Vero. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per preparare stock di oHSV ad alto titolo per studi in vitro sulla coltura cellulare e esperimenti su animali in vivo.

Una breve panoramica dell'intero protocollo è illustrata nella figura 1, che rappresenta i passaggi critici coinvolti nella crescita, purificazione e titolazione di oHSV. Cpe nelle cellule vero può essere rilevato già 4 h infezione post-HSV19. La figura 2 mostra cpe nelle cellule Vero in tre diversi punti di tempo a seguito dell'infezione da oHSV. Il livello del CPE è aumentato nel tempo. In questo protocollo, il 90-100% cpe è solitamente...

In questo manoscritto, descriviamo un semplice metodo di crescita, purificazione e titolazione del virus dell'herpes simplex oncolitico per uso preclinico.

Crescita, purificazione e titolazione del virus Oncolytic Herpes Simplex

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Il virus dell'herpes simplex oncolitico è una forma emergente di immunoterapia oncologica. Un efficiente sistema di propagazione, purificazione e determinazione titerica dei virus è fondamentale per l'uso in studi sperimentali. Questo metodo è molto semplice e può essere facilmente adottato in qualsiasi ambiente di laboratorio di livello di biosicurezza due per ricevere uno stock virale di alta qualità per studi preclinici.La produzione di uno stock virale puro e di alta qualità è fondamentale poiché viene utilizzato per studiare la risposta immunitaria antitumorale e sviluppare una nuova forma di immunoterapia oncologica a base di virus. Questo protocollo può essere utilizzato per purificare qualsiasi virus simplex di herpes di tipo selvatico o geneticamente modificato. Questo protocollo dovrebbe essere facile da leggere e facile da seguire per un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica prima.I materiali e i reagenti elencati devono essere in posizione prima di provare questa tecnica per la prima volta. Inizia lavando i mazzi T-150 di centimetri quadrati con DPBS di glucosio due volte alto integrato con 1%IFCS. Aspirare il DPBS e aggiungere sette millilitri di virus inoculo per pallone.Dondolare delicatamente i mazzi per cinque minuti e incubare a 37 gradi Celsius per 1,5-2 ore. Quindi, rimuovere l'inoculo e aggiungere 25 millilitri di DMEM integrati con 1%IFCS a ciascun pallone. Dopo l'incubazione a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per due o quattro giorni, raccogliere 20 millilitri del supernatante di coltura da ogni pallone in tubi di centrifuga da 50 millilitri.Utilizzando un raschietto per cellule, raschiare le cellule dal fondo dei contenitori. Aggiungere circa 15 millilitri del supernatante di coltura precedentemente raccolto a ciascun pallone per portare il volume a 20 millilitri, quindi utilizzare una pipetta sierologica sterile da 10 millilitri per lavare delicatamente il fondo dei contenitori alcune volte. Raccogliere le cellule con mezzi in tubi di centrifuga conica da 50 millilitri posti sul ghiaccio.Centrifugare i tubi a 300 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Resuspend ogni pellet accuratamente in 1,25 millilitri di tampone virale, o VB, e 1,25 millilitri di supernatante di coltura precedentemente raccolto. Mescolare tutti i pellet rimorsi in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri.Snap congelare le cellule rimorsidenti usando ghiaccio secco e 100% etanolo e conservare a meno 80 gradi Celsius. Scongelare le cellule congelate precedentemente spezzate in un bagno d'acqua calda a 37 gradi Celsius e sonicare per un minuto per tre cicli in un bagno d'acqua. Aggiungere 175 unità di Benzonasio Nucleasi e due microlitri di due cloruri millimolari di magnesio per millilitro del litorato cellulare e del vortice.Dopo un'incubazione di 30 minuti e un bagno d'acqua calda a 37 gradi Celsius, posizionare il tubo sul ghiaccio. Ruotare la lire cellulare a 300 volte G per 10 minuti. Raccogliere il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga conica da 50 millilitri e rimescolare il pellet cellulare in 500 microlitri di VB. Designarlo come pellet uno.Ruotare nuovamente il supernatante raccolto a 500 volte G per 10 minuti e conservare il supernatante separatamente in un tubo di centrifuga conico fresco da 50 millilitri da utilizzare in seguito. Rimorsi il pellet cellulare in 500 microlitri di VB, designarlo come pellet due. Unire il pellet rimorsinato uno e pellet due in un nuovo tubo di centrifuga e vortice da 1,75 millilitri e sonicare due volte in un bagno d'acqua prima di girare i tubi a 400 volte G per 10 minuti.Raccogliere il supernatante dal tubo di centrifuga da 1,7 millilitri e combinarlo con il tubo di centrifuga conico da 50 millilitri precedentemente raccolto. Filtrare il supernatante attraverso un filtro sterile a membrana PVDF da cinque micrometri in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri chiamato tubo uno. Aggiungere un millilitro di VB al tubo di centrifuga da 50 millilitri, svuotato dopo aver filtrato il supernatante dal passo precedente, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro a membrana PVDF posto sul tubo uno.Passare il filtrato dal tubo uno attraverso un filtro sterile a membrana MCE da 0,8 micrometri posto su un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri chiamato tubo due. Aggiungere un millilitro di VB al tubo svuotato uno, vortice, e passarlo attraverso lo stesso filtro MCE posto sul tubo due. Passare il filtrato dal tubo due attraverso un filtro PVDF sterile da 0,45 micrometri posto su un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri etichettato tubo tre.Come descritto in precedenza, ripetere il lavaggio del tubo due con un millilitro di VB per aggiungere filtrato al tubo tre. In questa analisi rappresentativa, l'effetto citopatico potrebbe essere osservato nelle cellule di Vero a 36, 48 e 72 ore dopo l'infezione da oHSV con l'arrotondamento delle cellule colpite. Il crescente livello di CPE nel tempo è evidente come visualizzato dall'espressione mCherry.A 72 ore dall'infezione, le placche virali sono state macchiate di X-gal per visualizzare gli OHSV con espressione lacZ. Pulire delicatamente le cellule infettate dal virus e lavare delicatamente il fondo sul pallone è fondamentale per mantenere intatta tutta la cellula infetta HSV in modo da ottenere un elevato stock virale di formicolio.

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Crescita, purificazione e titolazione del virus Oncolytic Herpes Simplex

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