Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Questo protocollo descrive come generare un profilo polisomico che rivela dettagli molecolari sull'attività dei ribosomi all'interno della cellula. Questa tecnica consente agli utenti di ottenere le preziose informazioni fornite da un profilo polisomico, che non hanno accesso a sistemi automatizzati di frazionamento del gradiente. Prenditi il tuo tempo durante la preparazione dei gradienti e conservali in un luogo in cui non vengano interrotti da un compressore o da altre operazioni meccaniche mentre si depositano in un gradiente lineare.

Per iniziare, preparare soluzioni madre di 7 e 47% di saccarosio in tampone sfumato di saccarosio. Filtrare sterilizzare le soluzioni di saccarosio attraverso un filtro da 0,22 micron. Preparare 14 millilitri di soluzioni di saccarosio al 17, 27 e 37% erogando e mescolando le soluzioni stock da 7 e 47%.

Posizionare sei provette da centrifuga in polipropilene in un rack per provette a vista completa. Assicurarsi che ci sia abbastanza spazio tra i tubi in modo che le azioni con un tubo non disturbino gli altri. Collegare un ago da nove pollici, 22 gauge con una punta smussata a una siringa da tre millilitri, ed eseguire un test di riempimento ed erogazione per garantire che la siringa possa contenere la soluzione di saccarosio senza gocciolare prima di impostare i gradienti.

Aggiungere due millilitri di saccarosio al 7% sul fondo di ciascuna provetta da centrifuga. Quindi, aggiungere due millilitri di saccarosio al 17% sotto la soluzione al 7%, posizionando la punta dell'ago nelle immediate vicinanze del fondo del tubo. Erogare attentamente e lentamente la soluzione.

Ripetere la procedura con due millilitri ciascuno della soluzione di saccarosio al 27, 37 e 47%, assicurandosi che ogni strato sia distinguibile dall'altro da una linea che segna la separazione delle densità. Conservare i gradienti a quattro gradi Celsius durante la notte per consentire loro di stabilirsi in una percentuale continua e crescente di saccarosio. Dopo la crescita e la raccolta del lievito, le cellule di Saccharomyces cerevisiae, risospendono le cellule in 700 microlitri refrigerati di tampone di estrazione polisomica.

Aggiungere 100 unità di inibitore della RNAsi. Quindi, aggiungere 400 microlitri di perle di vetro pre-refrigerate con una dimensione approssimativa da 425 a 600 micron. Trasferire la miscela in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri con le perle di vetro e interrompere le cellule di lievito agitando vigorosamente in un battiperline per cinque minuti.

Dopo aver interrotto le cellule, chiarire il lisato mediante centrifugazione. Determinare la concentrazione dell'RNA nel lisato chiarificato misurando l'assorbanza a 260 nanometri, utilizzando un sistema di rilevamento dell'RNA basato sulla fluorescenza. Assicurarsi che la concentrazione di RNA sia compresa tra 0,5 e un microgrammo per microlitro.

Se la concentrazione di RNA è troppo bassa, ridurre il volume del tampone di estrazione utilizzato per risospendere le cellule. Caricare con attenzione il lisato sulla parte superiore delle sfumature. Posizionare la punta della pipetta contro la parete interna nella parte superiore del tubo di polipropilene.

Inclinare il tubo e distribuire lentamente il lisato sulla parte superiore del gradiente, gocciolando contro il muro. Posizionare delicatamente i tubi nei secchi pre-refrigerati di un rotore a benna oscillante e centrifugare le pendenze. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura i tubi della centrifuga dal rotore del secchio oscillante e metterli in un supporto per tubi.

Etichettare le piastre a 96 pozzetti per conservare le frazioni e pre-raffreddarle sul ghiaccio. Raccogliere frazioni da 100 o 200 microlitri partendo dalla parte superiore del gradiente, inserendo con attenzione una punta di pipetta nella parte superiore del gradiente e raccogliendo le frazioni fino a quando l'intero gradiente non viene aliquotato. Misurare l'assorbanza di ciascuna frazione a 254 nanometri con uno spettrofotometro rispetto alle soluzioni di saccarosio al 7 e al 47% come spazi vuoti.

Create il profilo del polisoma tracciando il numero di frazione rispetto all'assorbanza. Sono mostrati tre profili polisomici rappresentativi del lievito S.Cerevisiae. La cresta di ogni subunità ribosomiale e picco polisomico è evidente su ciascun profilo.

Qui viene mostrato un profilo rappresentativo di un sistema automatizzato di frazionamento della densità. Questo profilo è stato prodotto da un profilo di assorbanza continua mentre il gradiente di saccarosio veniva spostato dal basso verso l'alto da una soluzione di inseguimento, attraverso una cella di flusso del rivelatore e raccolto in frazioni. Il profilo polisomico generato dal frazionamento manuale di campioni da 200 e 100 microlitri è mostrato qui.

La cosa più importante da ricordare con questa procedura è non interrompere i gradienti. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria o interrompere il gradiente erogando la soluzione troppo rapidamente. Seguendo questa procedura, l'RNA può essere estratto dai gradienti per ulteriori analisi per determinare gli mRNA che si associano ai ribosomi attivi