Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

Questo protocollo facilita lo screening di nuove formulazioni per comprendere meglio come le modifiche influenzano i loro tempi di permanenza dei tessuti, che è fondamentale nella progettazione di un sistema ottimale di somministrazione di farmaci. Questa tecnica non è invasiva e consente l'imaging in tempo reale, che riduce l'uso eccessivo di animali per il campionamento. I sistemi di somministrazione dei farmaci possono essere riprogettati per l'imaging e le applicazioni terapeutiche semplicemente includendo il farmaco terapeutico e la porzione di imaging in un unico nano-vettore.

Questo ha applicazioni utili sia nel trattamento del cancro che delle malattie infettive. A dimostrare la procedura sarà Rasha Msallam, un ricercatore senior del mio laboratorio. Per cominciare, due ore prima dell'iniezione subcongiuntivale, iniettare il topo per via endovenosa tramite la coda con 2,5 milligrammi per chilogrammo di blu evans o EB. Dopo aver sedato il mouse con il 5% di isoflurano, trasferire il mouse su un cono nasale e mantenere il mouse sedato su una piastra riscaldante.

Quindi, tagliare i baffi vicino all'occhio da iniettare. Instillare una goccia di soluzione di proxymetacaina cloridrato allo 0,5% direttamente sull'occhio. Quindi, caricare una siringa di vetro da 10 microlitri dotata di un ago calibro 32 con liposomi fluorescenti e assicurarsi che le bolle d'aria non siano presenti nella siringa.

Usando una pinzetta, sollevare la congiuntiva e iniettare lentamente i liposomi nello spazio subcongiuntivale, quindi prelevare lentamente l'ago, impedendo il riflusso. Garantire la formazione di bleb pieni di liposomi fluorescenti. Somministrare una goccia di acido fusitico all'1% sull'occhio e monitorare il mouse fino a quando non riprende conoscenza.

Accendere il sistema CLM. Collegare la sonda al sistema CLM. Scegli il campo visivo e la posizione per i file di acquisizione a questo punto.

Regolare l'intensità del laser per garantire che il rilevamento della fluorescenza per la fluoresceina DHPE sia nell'intervallo lineare e mantenere l'intensità coerente per il confronto tra le immagini scattate in diversi punti temporali. Dopo che il sistema è stato riscaldato per 15 minuti, calibrare il sistema secondo le istruzioni del produttore utilizzando il kit di calibrazione contenente le soluzioni di pulizia, risciacquo e fluoro-4 per ciascun laser. In breve, iniziare a calibrare immergendo la punta per cinque secondi ciascuno nel flaconcino detergente e quindi nel flaconcino di risciacquo.

Lasciare la punta in aria per la registrazione in background per normalizzare i valori di sfondo dalle diverse fibre delle sonde, garantendo l'uniformità dell'immagine. Ancora una volta, immergere la punta per cinque secondi nel flaconcino detergente e quindi nel flaconcino di risciacquo. Quindi, immergere la punta nel flaconcino contenente fluoro-4 488 nanometri per cinque secondi per normalizzare i valori del segnale.

Ripetere l'immersione della punta per cinque secondi nel flaconcino detergente seguito dal flaconcino di risciacquo. Tenere la punta nel flaconcino di risciacquo fino a quando il segnale di fluorescenza registrato nel passaggio precedente scompare. Quindi, trasferire la punta nel flaconcino contenente fluoro-4 660 nanometri per normalizzare i valori del segnale da diverse fibre nella sonda.

Dopo la calibrazione, assicurarsi che il valore sia inferiore a 100 per lo sfondo della sonda. Altrimenti, eseguire la pulizia ripetuta della sonda con un applicatore di punta di cotone. Accendere il regolatore di temperatura animale con una piastra riscaldante collegata e regolare la temperatura a 37 gradi Celsius.

Dopo aver coperto la piastra riscaldante con un telo chirurgico, fissare il cono del naso sulla piastra riscaldante. Dopo aver sedato il mouse utilizzando il 5% di isoflurano in una camera di induzione, trasferire il mouse al cono del naso e mantenere il mouse sedato su una piastra riscaldante. Quindi, instillare una goccia di soluzione anestetica di proxymetacaina cloridrato allo 0,5% sull'occhio.

Per lavare la superficie oculare ed evitare la cristallizzazione della lente, mantenere gli occhi lubrificati facendo cadere alcune gocce saline. Quindi, ruotare e regolare l'oculare del microscopio per visualizzare l'occhio del mouse in modo ergonomico nella messa a fuoco diretta a 0,67 volte l'ingrandimento. Accendere il laser e posizionare la sonda come una penna direttamente sulla regione dell'occhio da visualizzare.

Quindi, inizia a registrare l'acquisizione per osservare la fluorescenza nell'occhio nella regione di interesse. Interrompere la registrazione quando tutte le regioni sono contrassegnate ed etichettate in base alla mappa oculare per conoscere l'esatta posizione della sonda nella cornice esatta. I file di acquisizione verranno salvati automaticamente come file video nella posizione precedentemente scelta.

L'imaging a fluorescenza ha rivelato una netta differenziazione tra le regioni della sclera e della cornea. L'elevata vascolarizzazione dell'episclera e della congiuntiva ha causato la colorazione rossa della regione sclerale con EB. La cornea, che manca di vascolarizzazione, appariva nera. La fluorescenza di contrasto di limbus e sclera è stata osservata in uno studio di sette giorni.

I topi di controllo iniettati con colorante fluoresceina hanno confermato la specificità della fluorescenza derivata dai liposomi. Le intensità di fluorescenza erano elevate il primo e il terzo giorno. La fluorescenza verde ha rappresentato nel tempo la riduzione del liposoma nelle regioni limbus e sclera.

Le differenze nei segnali di fluorescenza dal primo giorno post-iniezione al terzo giorno nelle regioni del limbus temporale e del limbus superiore non erano significative, indicando la preferenza dei liposomi neutri per la regione del limbus, in particolare la periferia corneale. Per le regioni temporali e superiori al primo giorno post-iniezione, la fluorescenza nella sclera era sei volte superiore rispetto al limbus. Entro il terzo e il settimo giorno, i liposomi erano significativamente ridotti nella sclera nelle regioni temporali e superiori, attribuiti ai meccanismi di clearance oculare.

La quantità più bassa di fluorescenza è stata rilevata nelle regioni nasali e inferiori, a causa della distanza dal sito di iniezione. È importante etichettare i fotogrammi fleck in base alla mappa oculare prima che la registrazione venga interrotta. Mantieni costante l'intensità del laser e definisci il valore di sfondo massimo per un confronto corretto tra diversi esperimenti.

Dopo l'identificazione delle formulazioni di piombo, possono essere condotti studi completi di farmacocinetica e biodistribuzione negli animali per studiare la biodisponibilità del farmaco e convalidare l'efficacia terapeutica delle loro formulazioni.