Migrazione nucleare nell'ovocita di Drosophila
13 maggio 2021
In Drosophila, il nucleo dell'ovocita subisce una migrazione microtubule-dipendente durante l'oogenesi. Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per seguire la migrazione eseguendo l'imaging dal vivo su camere di uova ex-vivo. La nostra procedura mantiene in vita le camere delle uova per 12 ore per acquisire filmati time-lapse 3D multi-posizione utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.
Questa tecnica consente di osservare lunghi processi biologici in camere di uova di Drosophila sezionate, come la migrazione nucleare degli ovociti, utilizzando la microscopia di imaging dal vivo. Questo protocollo descrive come mantenere in vita le camere delle uova sezionate per 12 ore per eseguire la microscopia di imaging dal vivo. Per iniziare, pipettare 200 microlitri di Schneider Medium e integrare con 30 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di insulina, quindi aggiungere quattro microlitri di siero fetale di vitello inattivato dal calore.
Utilizzare una punta della pipetta per applicare una piccola quantità di grasso siliconico intorno al foro sul lato inferiore della diapositiva forata. Posizionare un coverslip e utilizzare l'estremità larga di una punta della pipetta per applicare pressione sul coverslip per appiattire il grasso siliconico per creare un anello in silicone interno alla diapositiva. Trasferire le mosche femminili anestetizzate nel pozzo di dissezione contenente 150 microlitri del mezzo di imaging.
Per sezionare la femmina, utilizzare la pinna per afferrare il torace e pizzicare la cuticola dell'addome dorsale con un secondo paio di pinci. Rimuovere con cura l'utero, l'ovidotto e la guaiina muscolare. Isolare e staccare la coppia di ovaie visibili all'apertura della cuticola.
Posizionare una goccia da 10 a 15 microlitri del mezzo di imaging sulle ovaie e trasferire un'ovaia nella camera di imaging. Per separare gli ovarioli, utilizzare l'ago per tenere l'estremità posteriore dell'ovaio. Utilizzare un altro ago per tirare con cura il germarium per stuzzicare gli ovarioli a parte.
Tenere la guaina con un ago e tirare l'ovariole attraverso le camere più grandi con un altro ago per rimuovere la guaina muscolare rimanente sulle camere dell'uovo. Lasciare affondare l'ovariole non infessato e contattare il coperchio. Rimuovere le fasi tardive e il resto delle ovaie dalla microcamera usando una pinica.
Utilizzare aghi per distanziare attentamente gli ovarioli per facilitare l'acquisizione. Tagliare un piccolo quadrato di 10 per 10 millimetri della membrana permeabile. Applicare con attenzione la membrana sulla parte superiore del mezzo di imaging per espellere eventuali bolle d'aria.
Quindi sigillare ermeticamente la camera con un sottile strato di olio di alocarburi attorno al pozzo sul contorno della membrana. Posizionare la configurazione dell'immagine sul supporto del vetrino del microscopio invertito e utilizzare un obiettivo 40X. La migrazione del nucleo ovocitario di una camera di uova wild type è stata catturata utilizzando la microscopia di imaging dal vivo.
Il nucleo raggiunge la membrana plasmatica anteriore o la membrana plasmatica laterale prima di scivolare lungo le traiettorie per raggiungere la sua posizione finale all'intersezione delle due membrane plasmatiche. Deformità di membrana, cellule follicolari disorganizzate, cellule rachitiche e nuclei rimpiccioliti sono i primi segni di camere d'uovo morenti. L'ovocita degenerato prima di otto ore di imaging di solito non viene rilevato.
Tuttavia, rari casi di degenerazione precoce sono dovuti a problemi durante la dissezione o le fasi di montaggio. Danneggiare le camere delle uova compromette la loro sopravvivenza. Quindi la delicata dissezione precisa a mano e la preparazione della microcamera sono fondamentali.
Questa procedura ci ha permesso di visualizzare che il nucleo dell'ovocita può prendere tre diverse traiettorie durante la sua migrazione e diversi organelli regolano queste traiettorie all'interno dell'ovocita.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per osservare la migrazione nucleare negli oociti di Drosophila mediante microscopia in tempo reale. La tecnica consente di mantenere camere ovariche dissezionate per 12 ore, permettendo l'acquisizione di filmati in 3D con riprese multiple a intervalli di tempo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Drosophila funge da organismo modello per lo studio dell'ovogenesi.
- La migrazione dipendente dai microtubuli è cruciale per lo sviluppo dell'ovocita.
- Le tecniche di imaging in tempo reale migliorano la comprensione dei processi cellulari dinamici.
- Il mantenimento della vitalità delle camere ovariche è essenziale per l'imaging a lungo termine.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'immagine in tempo reale della migrazione nucleare nell'oocita.
- Mantenere camere ovariche vive per periodi prolungati durante l'osservazione.
- Utilizzare la microscopia confocale a disco rotante per acquisizioni dettagliate.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del mezzo di Schneider integrato con insulina e siero fetale di vitello.
- Applicazione di grasso al silicone per creare un ambiente di imaging stabile.
- Dissezione di mosche femmine per ottenere camere embrionali da sottoporre a imaging.
- Utilizzo della microscopia confocale a disco rotante per acquisire filmati in time-lapse.
Risultati principali
- Mantenimento con successo delle camere ovariche per 12 ore durante l'acquisizione delle immagini.
- Visualizzazione chiara dei processi di migrazione nucleare dell'ovocita.
- Dimostrazione dell'efficacia delle tecniche di imaging in tempo reale.
- Contributo alla comprensione della biologia dello sviluppo in Drosophila.
Conclusioni
- Il protocollo consente un'osservazione dettagliata della dinamica degli oociti.
- L'immagine in tempo reale fornisce informazioni sui meccanismi di migrazione cellulare.
- Questo metodo può essere applicato ad altri processi biologici in Drosophila.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la dinamica della migrazione nucleare in sistemi modello come gli oociti di Drosophila fornisce informazioni fondamentali sulla regolazione del citoscheletro e sui meccanismi di trasporto intracellulare, rilevanti per la validazione degli obiettivi negli assay basati su cellule. L'immagine in tempo reale del movimento tridimensionale degli organelli permette di ridurre i rischi meccanicistici delle ipotesi che coinvolgono proteine motrici, stabilità dei microtubuli o stabilimento della polarità—aspetti chiave nella fase iniziale della scoperta, in cui lo screening fenotipico si basa su letture subcellulari. Questo approccio sostiene la previsione affidabile collegando perturbazioni molecolari a comportamenti cellulari osservabili e quantificabili in un sistema rilevante per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai regolatori del citoscheletro e alle proteine di posizionamento nucleare attraverso la visualizzazione diretta delle traiettorie di migrazione.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale delle target mediante la correlazione tra perturbazioni genetiche o farmacologiche e alterazioni nei modelli tridimensionali di movimento nucleare.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Favorisce la standardizzazione dei saggi fornendo letture quantitative e risolte nel tempo della posizione nucleare e della cinetica di migrazione in un ambiente di imaging controllato e a lungo termine.
- Valore operativo: Migliora la prontezza per lo screening attraverso la preparazione riproducibile delle camere e la stabile vitalità delle camere ovariche di Drosophila per un periodo fino a 12 ore, consentendo confronti tra più condizioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre un sistema rilevante per la patologia per studiare difetti di polarità associati a disturbi dello sviluppo, sostenendo l'esplorazione di biomarcatori traslazionali attraverso la correlazione tra malslocalizzazione nucleare e esiti fenotipici.
- Valore operativo: Favorisce la continuità traslazionale permettendo di convalidare scoperte della fase di ricerca in un modello geneticamente accessibile e compatibile con l'analisi in tempo reale, prima della traduzione nei sistemi mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino all'ottimizzazione del saggio e alla validazione preclinica, in particolare quando la dinamica nucleare o la funzione del citoscheletro sono centrali nel meccanismo d'azione.
- Biologia della Scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico visualizzando in tempo reale come specifici silenziamenti genici o trattamenti con composti alterino la migrazione nucleare.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso l'allestimento standardizzato delle camere e il tracciamento quantitativo in 3D della posizione nucleare come lettura funzionale degli effetti dei composti.
- Analisi: Genera parametri misurabili come la velocità di migrazione, la scelta della traiettoria e la posizione finale del nucleo, che possono essere confrontati statisticamente tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Si collega ai lavori preclinici stabilendo un legame causale tra difetti nel posizionamento nucleare e fenotipi dello sviluppo, fornendo informazioni utili per decisioni di avanzamento con valutazione del rischio.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per lo studio del trasporto intracellulare, del posizionamento degli organelli o dell'instaurazione della polarità in diversi progetti di biologia dello sviluppo e biologia cellulare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei meccanismi bersaglio riducendo l'ambiguità su come gli interventi molecolari influenzino l'organizzazione e la dinamica subcellulare.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie a un protocollo validato di preparazione della camera che mantiene la vitalità del tessuto per un'imaging prolungata in tempo reale.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o abbandono del progetto fornendo precoci indicatori fenotipici osservabili per bersagli coinvolti nella regolazione del citoscheletro o nel trasporto intracellulare.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sull'impatto dimostrato sulla migrazione nucleare, un processo collegato al destino cellulare e all'integrità dello sviluppo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione di Drosophila, nell'immagine microscopica in tempo reale e nella preparazione di campioni fluorescenti.
- Richiede l'accesso a un microscopio confocale a disco rotante o a sistemi equivalenti per l'acquisizione tridimensionale a lungo termine dotati di controllo ambientale.
- Necessita della standardizzazione della sigillatura della camera e della composizione del mezzo tra diversi gruppi di lavoro, al fine di garantire la sopravvivenza costante delle camere ovariche.
- Richiede considerazioni di adattamento nell'applicare il sistema della camera ad altri tipi di tessuti o stadi dello sviluppo al di là della medio-ogenesi.
- È limitato dalla rilevanza fisiologica di Drosophila per le malattie umane, richiedendo una validazione ortogonale in sistemi mammiferi per gli obiettivi traslazionali.
