Un sistema O9-1/Hydrogel ottimizzato per lo studio dei segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale

Il metodo aiuta nello studio della segnalazione meccanica delle cellule della cresta neurale e della sua interazione con i segnali chimici. Può anche aiutare nei meccanismi molecolari e genetici dello sviluppo della cresta neurale nelle malattie. Trasferire gli slip di copertura in vetro è il più impegnativo quindi trasferirli lentamente e con attenzione per evitare di romperli e farli cadere.

A dimostrare la procedura saremo io e la dottoressa Sherry Zhao, una borsista post-dottorato del mio laboratorio. Inizia posizionando il numero desiderato di coperchi di vetro su un pezzo di salvietta da laboratorio. Quindi sterilizzare ogni coperchio scivola facendolo passare avanti e indietro attraverso la fiamma del bruciatore di alcol.

Quando il coperchio scivola si raffredda, coprire lo slittamento del coperchio da 12 millimetri con circa 200 microlitri e lo slittamento del coperchio da 25 millimetri con 800 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1. Dopo cinque minuti, aspirare l'idrossido di sodio e lasciare asciugare all'aria il coperchio per cinque minuti per formare un film uniforme. Una volta asciugati i coperchi, aggiungere circa 18 microlitri di aminopropil trietossisilano o APTS su uno slittamento di copertura da 12 millimetri e 150 microlitri di APTS su uno slittamento di copertura da 25 millimetri.

Aspirare l'accesso APTS per consentire all'APTS residuo di asciugarsi per cinque minuti. Successivamente, risciacquare le coperture scivola tre volte immergendole in acqua deionizzata sterile per cinque minuti ogni volta. Spostare il coperchio lavato scivola su una capsula di Petri fresca con il lato reattivo rivolto verso l'alto.

E trattare le scivolate di copertura immergendo abbastanza 0,5% di glutaraldeide per 30 minuti. Dopo aver aspirato la glutaraldeide, sciacquare il coperchio scivola una volta con acqua deionizzata per tre minuti e asciugare all'aria il coperchio scivola con il lato reattivo verso l'alto. Per preparare gli slip di copertura siliconati, posizionare lo stesso numero di slip di copertura come quella copertina rivestita di aminosilano scivola in una capsula di Petri rivestita con para film.

Quindi, trattare gli slittamenti di copertura da 12 millimetri con 40 microlitri e gli slittamenti di copertura da 25 millimetri con 150 microlitri di diclorometano silano o DCMS per cinque minuti. Lavare i vetri di copertura con acqua deionizzata sterile una volta per un minuto prima di posizionare gli slip reattivi del coperchio rivolti verso l'alto su una salvietta da laboratorio. Per preparare gli idrogel, pipettare la soluzione di gel di acrilammide appena preparata sugli slip di copertura rivestiti di aminosilano essiccato.

Utilizzando una pinzetta curva, trasferire immediatamente il coperchio trattato con DCMS sulla parte superiore della soluzione di gel con il lato trattato che tocca la soluzione di gel, quindi inserire il sandwich della soluzione di gel tra due scivolate di copertura. Una volta che il gel è polimerizzato, separare il coperchio trattato DCMS scivolare con pinzette curve, lasciando scivolare il gel attaccato al coperchio rivestito di aminosilano. Quindi, immergere lo slittamento del coperchio da 12 millimetri con l'idrogel collegato in una piastra predeterminata a 4 pozzetti o 24 pozzetti coperta con 500 microlitri di PBS sterile o acqua deionizzata e il coperchio da 25 millimetri scivolare in una piastra a 6 pozzetti coperta con due millilitri di PBS sterile o acqua deionizzata per 30 minuti.

Dopo aver rimosso la soluzione di acrilammide in eccesso, conservare gli idrogel in PBS sterile o acqua deionizzata a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, aspirare PBS o acqua deionizzata dalla piastra del pozzo prima di aggiungere soluzione di Sulfo-succinimydyl o Sulfo-SUNPAH per coprire completamente il gel. E posizionare i gel con la soluzione sotto una luce ultravioletta da 15 watt e 365 nanometri scoperta per 10 minuti.

Raccogliere il più possibile il Sulfo-SANPAH per soluzione inclinando la piastra. E poi lavare il gel due o tre volte con 15 MILLIMOLARI HEPES. Aggiungere 15 milligrammi per millilitro collagene 1 diluito in acido acetico allo 0,2% a ciascun pozzo contenente l'idrogel.

E incubare i gel durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, eseguire il lavaggio come descritto nel manoscritto prima di incubare gli idrogel con PBS contenenti il 10% di siero di cavallo e il 5% di FBS a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica. Dopo due ore di incubazione, aggiungere 500 microlitri di DMEM filtrato sterile con 10% FBS e 1% penicillina streptomicina a ciascun pozzetto e conservare i gel a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Quando la coltura cellulare è pronta, piastra circa 1,5 volte 10 alla quarta 09-1 cellule per centimetro quadrato nel mezzo bazell. Utilizzare una pinzetta per trasportare le scivolate di copertura su una nuova piastra per ridurre al minimo i falsi segnali provenienti dalle cellule cresciute direttamente sulla piastra. Quindi, fissare le cellule utilizzando 500 microlitri di paraformaldeide al 4% per 10 minuti prima di trattare le cellule con 500 microlitri dello 0,1% tritone X-100 a temperatura ambiente.

Dopo 15 minuti, cammina le cellule con 250 microlitri di siero d'asino al 10%. Colorare le cellule per F-actina con felodipina ad una diluizione da 1 a 400 in 250 microlitri di siero d'asino al 10%, seguita da incubazione con DAPI per 10 minuti. Lavare le celle con PBS per due minuti prima di aggiungere da tre a quattro gocce di terreno di montaggio per ciascun pozzetto.

Su un microscopio a fluorescenza, cattura le immagini di almeno tre fotogrammi casuali per campione di idrogel che producono canali singoli e uniti. Nella valutazione della rigidità dell'idrogel attraverso la microscopia a forza atomica o AFM, la pendenza della curva di forza era delicata per gli idrogel morbidi poiché la forza richiesta dalla sonda AFM era inferiore. Tuttavia, su idrogel rigidi, la pendenza generata era molto più ripida.

Le misurazioni AFM sono state quindi utilizzate per calcolare la rigidità media degli idrogel dal modulo elastico di Young in kilopascal. Le caratteristiche di crescita delle cellule P19 e 09-1 sono state osservate in idrogel di controllo e 40 kilopascal di sistemi di controllo e gel modificati. Le cellule 09-1 cresciute sui sistemi gel originali hanno portato a un numero maggiore di cellule morte.

Al contrario, le cellule 09-1 cresciute sui sistemi di gel modificati hanno mostrato una crescita cellulare sana e un sufficiente attaccamento al substrato di idrogel con un piccolo mazzo cellulare indicato da cellule rotonde minime. Le celle P19 placcate su entrambi i sistemi idrogel mostravano un eccesso di celle galleggianti rotonde e una mancanza di attacchi al substrato cellulare. La compatibilità delle cellule della cresta neurale o NCC con il sistema idrogel modificato è stata valutata mediante colorazione immunofluorescente per AP-2.

È stato osservato un aumento significativo dell'espressione di AP-2 nelle cellule 09-1 placcate sul sistema idrogel modificato. Inoltre, le cellule 09-1 hanno mostrato morfologie diverse in base agli idrogel a bassa o alta rigidità attraverso quantità variabili di fibre di stress. L'espressione anti-vinculina nelle cellule 09-1 coltivate sull'idrogel da 40 kilopascal era superiore a quella coltivata sull'idrogel di un kilopascal, riflettendo che le cellule cresciute su substrati più morbidi formano complessi di addizione focale minimi rispetto al substrato rigido.

Un tempo di attesa appropriato è fondamentale per la polimerizzazione degli idrogel poiché gli acrilammidi sono tossici per le cellule. Immergere gli idrogel in PBS o acqua deionizzata per almeno 30 minuti per garantire risultati migliori.