Name: Un sistema O9-1/Hydrogel ottimizzato per lo studio dei segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Impara a studiare i segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale O9-1 utilizzando idrogeli di poliacrilammide con rigidità variabile. Questo metodo ottimizzato rivela le interazioni tra segnali meccanici e chimici nello sviluppo embrionale.

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Ringraziamo la dott.ssa Ana-Maria Zaske, operatore della struttura Atomic Force Microscope-UT Core presso l'Università del Texas Health Sciences Center, per l'esperienza apportata in AFM in questo progetto. Ringraziamo anche le fonti di finanziamento del National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 e R01HL142704 a J. Wang).

1. Preparazione dell'idrogel
NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa di coltura cellulare che è stata disinfettata con etanolo e ultravioletto (UV) sterilizzato prima dell'uso per mantenere la sterilità. Gli strumenti, come pinzette e pipette, devono essere spruzzati con etanolo. Anche le soluzioni tampone devono essere filtrate sterili.
<ol><li>Preparazione di coperture in vetro rivestite di aminosilano<ol>
<li>Posizionare il numero desiderato di coperture in vetro su un pezzo di salvietta da laboratorio. NOTA: preparare altri 3-4 coverslip per garantire forniture di backup sufficienti quando si rompono facilmente. Diversi materiali di coperture in vetro produrranno una diversa compatibilità di semina e fissaggio delle cellule. È meglio determinare quale tipo si adatta meglio all'esperimento prima di iniziare gli esperimenti (vedi la Tabella dei materiali).</li>
		<li>Utilizzare un bruciatore ad alcool o un bruciatore Bunsen per sterilizzare ogni coverslip facendolo passare avanti e indietro attraverso la fiamma (30 s per esperimenti di analisi proteica). Posizionare ogni coverlip di vetro su una salvietta da laboratorio per raffreddare.</li>
		<li>Una volta raffreddate le coperture in vetro, trasferirle su una capsula di Petri rivestita di parafilm per evitare lo slittamento. NOTA: Se i coperchi non sono abbastanza freddi, il calore residuo scioglierà il parafilm sugli scivoli, rendendoli inutilizzabili.</li>
		<li>Coprire i coverslip con circa 200 μL e 800 μL di 0,1 M NaOH per un coverslip di 12 mm e un coverslip da 25 mm, rispettivamente, e lasciarli riposare per 5 min. Quindi, aspirare il NaOH 0,1 M e lasciare asciugare all'aria i coperchi per altri 5 minuti per formare un film uniforme.</li>
		<li>Una volta asciugati i coverslip, pipettare circa 80 μL e 150 μL di 3-aminopropil trietossisilano (APTS) per 12 mm e 25 mm, rispettivamente. Fare attenzione a non versare la soluzione sul parafilm. Lasciare riposare la soluzione per 5 minuti.</li>
		<li>Aspirare il più possibile APTS in eccesso e lasciare asciugare l'APTS residuo per 5 minuti. Risciacquare bene le coverslip immergendole in sterile, deionizzato (DI) H2O tre volte per 5 minuti ogni volta. NOTA: Se le coperture in vetro non vengono risciacquate bene, l'APTS residuo provoca reazioni indesiderate con glutaraldeide, causando la formazione di un precipitato bianco e causando coperture inutilizzabili.</li>
		<li>Spostare le coperture in una nuova capsula di Petri con il lato reattivo rivolto verso l'alto. Aggiungi abbastanza glutaraldeide allo 0,5% alla capsula di Petri per coprire interamente le coperture e lasciare riposare le coperture per 30 minuti.</li>
		<li>Aspirare la glutaraldeide allo 0,5% e risciacquare nuovamente le coverslips in DI H2O una volta per 3 min. Impostare i coverslips lato reattivo su una salvietta da laboratorio o una capsula di Petri pulita per asciugare completamente all'aria prima dell'uso. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui; I coperchi devono essere posti in DI H2O sterili fino all'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di coverslip siliconati<ol>
<li>Posizionare lo stesso numero di coverslip delle coverslip rivestite di aminosilano (punto 1.1.1) in una capsula di Petri rivestita di parafilm.</li>
		<li>Pipettare 40 μL o 150 μL per coperchi da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di diclorometilsilano (DCMS) su un lato del coperchio e lasciare riposare la soluzione per 5 minuti.</li>
		<li>Aspirare qualsiasi soluzione rimanente dal coperchio, lavare in DI H2O sterile una volta per 1 minuto e posizionare le coperture reattive rivolte verso l'alto su una salvietta da laboratorio per asciugare completamente all'aria prima di passare alla fase successiva.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di idrogel<ol><li>Mescolare acrilammide, bis-acrilammide e DI H2O in un tubo centrifugo da 1,5 mL per preparare 500 μL di soluzioni con rigidità variabili (vedere Tabella 1). Vortice la soluzione per 30 s per mescolarla accuratamente.</li>
		<li>Lavorando rapidamente, aggiungere la soluzione di persolfato di ammonio al 10% (APS) e la tetrametiletilendiammina (TEMED) al tubo e ruotare nuovamente le soluzioni per miscelare le soluzioni. NOTA: Preparare un APS fresco al 10% e lasciarlo sul ghiaccio o congelarlo in aliquote monouso a causa del suo delicato ciclo di congelamento/scongelamento.</li>
		<li>Pipettare circa 33 μL o 100 μL della soluzione sui coperchi essiccati da 12 mm o 25 mm rivestiti di aminosilano (rispettivamente punto 1.1).</li>
		<li>Utilizzando una pinzetta curva, posizionare immediatamente il coverslip trattato con DCMS sopra la soluzione di gel con il lato trattato che tocca la soluzione gel, inserendo così la soluzione gel tra il coverslip trattato con DCMS e il coverslip rivestito con aminosilano.</li>
		<li>Lasciare polimerizzare la soluzione di gel per 5-15 minuti, monitorando attivamente la polimerizzazione su gel della soluzione rimanente nel tubo.</li>
		<li>Una volta che il gel è polimerizzato, separare il coverslip trattato con DCMS con una pinzetta curva o una lama di rasoio, lasciando il gel attaccato alla coverslip originale rivestita di aminosilano.</li>
		<li>Posizionare immediatamente il coverslip con l'idrogel attaccato in una piastra predeterminata a 4 pozzetti/24 pozzetti e 6 pozzetti ricoperta da 500 μL e 2 mL di PBS sterile o DI H2O per coperture da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, per evitare che il gel si secchi.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.3.4-1.3.7 per tutti i coverslip.</li>
		<li>Immergere gli idrogel in PBS sterile o DI H2O per 30 minuti per rimuovere la soluzione di acrilammide in eccesso. Conservare gli idrogel in PBS sterile o DI H2O a 4 °C per una sosta procedurale qui.</li>
		<li>In una stanza buia, preparare la miscela di esanoato di esatanoato (sulfo-SANPAH) di sulfosuccinimidile 6-(4'-azido-2'-azido-2'-azido-2'-azido-2'-idrossietil) piperazin-1-il] (HEPES) (pH = 8,5) con 25 μL di 50 μl di sulfo-SANPAH da 50 μg / mL in un tubo conico, avvolto in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce. Utilizzare una pipetta per mescolare bene la soluzione prima dell'uso. NOTA: Un volume di 2,5 mL di soluzione di sulfo-SANPAH è sufficiente per circa venticinque idrogel da 12 mm o cinque idrogel da 25 mm.</li>
		<li>Aspirare PBS o DI H2O dalla piastra del pozzo. Aggiungere circa 100 μL o 500 μL per coperture da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di soluzione di sulfo-SANPAH (fase 1.3.10) per coprire il gel. Assicurarsi che la soluzione copra interamente il gel. NOTA: Regolare la forza di aspirazione del vuoto per evitare che la forte forza strappi o disturbi gli idrogel.</li>
		<li>Posizionare i gel con la soluzione sotto una luce UV da 15 W, 365 nm per 10 minuti, scoperta per ridurre al minimo qualsiasi interferenza della luce UV che reagisce con il sulfo-SANPAH.</li>
		<li>Aspirare il sulfo-SANPAH in eccesso inclinando la piastra per raccogliere il più possibile la soluzione. Lavare il gel con 50 mM HEPES due o tre volte.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL e 2 mL per gel da 12 mm e 25 mm, rispettivamente, di collagene I da 50 mg/mL diluiti in acido acetico allo 0,2% in ciascun pozzetto contenente l'idrogel. Lasciare incubare i gel durante la notte in un incubatore a CO2 a 37 °C, 5%. NOTA: Diluire il collagene I in acido acetico allo 0,2% invece di 50 mM HEPES per promuovere la distribuzione omogenea e l'attaccamento del collagene I.</li>
		<li>Aspirare il collagene I e lavare i gel con PBS sterile tre volte per rimuovere il collagene in eccesso I per 5 minuti ogni lavaggio. Incubare gli idrogel in PBS con 10% siero equino, 5% FBS per 2 ore nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2. NOTA: L'aggiunta del 10% di siero equino promuove una maggiore proliferazione rispetto al solo utilizzo di FBS come fatto nella pubblicazione precedente.</li>
		<li>Aspirare il mezzo. Aggiungere 500 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) filtrato sterile con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (P/S) a ciascun pozzetto. Conservare i gel nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2 fino a quando non sono pronti per la coltura cellulare.</li>
		<li>Una volta pronto, impiattare circa 1,5 × 104 cellule O9-1 / cm2 in mezzo basale nei piatti di coltura. Incubare le cellule per 2 giorni in un incubatore a 37 °C, 5% CO2. Controllare la confluenza delle cellule per assicurarsi che le cellule siano sufficientemente attaccate ai gel e che il numero di cellule sia sufficiente prima di raccogliere per l'analisi. NOTA: vedere il protocollo pubblicato in precedenza per le fasi di recupero, passaggio e raccolta delle celle O9-120.</li>
		<li>Procedere alle sezioni 2, 3 o 4 per un'ulteriore analisi degli idrogel.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analisi quantitativa della rigidità tramite AFM
<ol><li>Avviare il computer del sistema AFM, seguito dal controller AFM (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Montare il cantilever AFM sul portasonda AFM. Utilizzare un cantilever sferico con una perla di silice da 0,5 μm montata all'estremità del cantilever (cantilever con perla sferica). NOTA: per idrogel più rigidi, come 10 kPa, 20 kPa e 40 kPa, è stata utilizzata una sonda più rigida con la costante della molla di 0,24 N/m. Una sonda più morbida è stata utilizzata per idrogel più morbidi, come 0,5 kPa e 1 kPa, con una costante di molla di 0,059 N / m.</li>
	<li>Impostare il software AFM in modalità contatto.</li>
	<li>Montare il wafer di silicio sullo stadio campione AFM per raccogliere le curve di forza facendo clic su Engage affinché il cantilever tocchi il substrato di silicio, generando così le curve di forza.</li>
	<li>Utilizzare le curve di forza sopra (2.4) per la calibrazione, fare clic su Calibra nel software di controllo per ottenere una costante media della molla del cantilever in condizioni di regolazione termica e salvare i valori calibrati nel software di controllo.</li>
	<li>Montare i campioni posizionando il coperchio con l'idrogel collegato in una capsula di Petri da 60 mm sullo stadio di scansione AFM. Aggiungere 3 ml di PBS nella piastra prima di effettuare misurazioni per evitare che il gel si secchi.</li>
	<li>Impostare l'AFM in modo che funzioni in modalità contatto (fluido) per avviare la misurazione. Impegnare il tallone sferico per toccare e sollevare continuamente dal campione di gel.</li>
	<li>Impostare il cantilever in modo che la sua soglia di deflessione rimanga a 10 nm. Mantenere la dimensione di rampa della sonda a 10 μm. Quindi, registrate le curve di forza come nel passaggio 2.4.</li>
	<li>Acquisire almeno 20 curve di forza da almeno 3 a 10 punti diversi sulla superficie dell'idrogel.</li>
	<li>Calcola il modulo medio di Young di ~ 20 curve di forza per ogni punto con il software di imaging e analisi AFM. Utilizzate le curve di forza di rampa di estensione e un modello linearizzato (sferico). Calcola la media di tutti i punti per ciascun campione per ottenere la rigidità finale. NOTA: il modulo di Young e i dati correlati (adesempio, deviazioni standard) vengono automaticamente salvati come foglio di calcolo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.6-2.10 per tutti i campioni.</li>
</ol>3. Analisi molecolare della rigidità mediante colorazione ad immunofluorescenza
<ol><li>Utilizzare una pinzetta per trasportare il coverslip su una nuova piastra per ridurre al minimo i falsi segnali provenienti dalle cellule cresciute direttamente sulla piastra. Lavare le cellule con 500 μL di PBS sterile tre volte per rimuovere le cellule morte e qualsiasi terreno di coltura rimanente.</li>
	<li>Fissare le celle utilizzando 500 μL di paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 minuti a temperatura ambiente, indisturbati. Quindi, lavare nuovamente le cellule tre volte utilizzando 500 μL di PBS / pozzetto per 2 minuti ciascuna. NOTA: Conservare a 4 °C per un arresto procedurale.</li>
	<li>Trattare le cellule con 500 μL di 0,1% Triton X-100 per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le cellule tre volte con 500 μL di PBS / pozzetto.</li>
	<li>Bloccare le cellule con 250 μL di siero d'asino al 10% (diluito in PBS e 0,1% Tween 20) per pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare le cellule con 250 μL di anticorpi primari per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C. Quindi, lavare le cellule tre volte con 500 μL di PBS / pozzetto per 5 minuti ciascuna. NOTA: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) e anti-AP2 alfa (1:250) sono stati utilizzati in questo esperimento e sono stati diluiti in siero d'asino al 10%.</li>
	<li>Incubare le cellule con corrispondenti anticorpi secondari e/o falloidina utilizzati per la colorazione di F-actina ad una diluizione di 1:400 in 250 μL di siero d'asino al 10% per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare le celle tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna. NOTA: 568 nm Di falloidina può essere co-incubata con anticorpi secondari a 488 nm o 647 nm o da sola.</li>
	<li>Incubare le cellule con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, diluizione 1:1000) in 250 μL di PBS per 10 min seguito da un ultimo lavaggio di PBS per 2 min.</li>
	<li>Aggiungere 3-4 gocce di mezzo di montaggio a ciascun pozzetto. Conservare i campioni a 4 °C per impostare per almeno 2 ore prima dell'imaging per assicurarsi che il supporto di montaggio sia impostato correttamente.</li>
	<li>Cattura immagini di almeno 3 fotogrammi casuali per campione di idrogel con un microscopio a fluorescenza, producendo canali singoli e uniti.</li>
</ol>4. PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
<ol><li>Trasferire gli idrogel con le cellule aderenti per la raccolta dell'RNA in una nuova piastra per ridurre al minimo l'RNA indesiderato dalle cellule attaccate alla piastra cellulare. Lavare le cellule con PBS tre volte per rimuovere le cellule morte e il terreno di coltura.</li>
	<li>Estrarre l'mRNA totale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA. Eseguire la trascrizione inversa dell'RNA in cDNA utilizzando un supermix a trascrizione inversa seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Eseguire RT-qPCR con primer per Vcl come marcatore di rigidità di scelta e analizzare utilizzando il metodo 2-ΔΔCT. NOTA: Sequenza di primer di Vcl: Forward 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; inverso 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

L'obiettivo del presente studio è quello di fornire un sistema in vitro efficace ed efficiente per comprendere meglio l'impatto dei segnali meccanici negli NCC. Oltre a seguire il protocollo passo-passo sopra menzionato, i ricercatori devono tenere presente che la coltura cellulare di NCC O9-1 è influenzata dal tipo di coverslip di vetro utilizzati per preparare gli idrogel. Ad esempio, è stato notato che le cellule seminate su un tipo specifico di coverslip di vetro (vedi la Tabella dei materiali)</stro...

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono un gruppo di cellule staminali durante l'embriogenesi dei vertebrati con una notevole capacità di migrare e contribuire allo sviluppo di vari organi e tessuti. Le NCC possono differenziarsi in diversi tipi di cellule, tra cui neuroni sensoriali, cartilagine, ossa, melanociti e cellule muscolari lisce, a seconda della posizione di origine assiale e della guida ambientale locale dell'NCC1,2. Con la capacità di differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule, le anomalie genetiche che causano la disregolazione in qualsiasi fase dello sviluppo della cresta neurale (NC) possono portare a numerose malattie congenite2. Ad esempio, le perturbazioni durante la formazione, la migrazione e lo sviluppo di NCC portano a disturbi dello sviluppo noti collettivamente come neurocristopatie1,3. Queste malattie vanno dai difetti craniofacciali dovuti al fallimento nella formazione di NCC, come la sindrome di Treacher Collins, allo sviluppo di vari tumori dovuti alla capacità migratoria metastatica dell'NCC, come si vede nel melanoma3,4,5,6. Negli ultimi decenni, i ricercatori hanno fatto notevoli scoperte sui ruoli e i meccanismi delle NCC nello sviluppo e nelle malattie, con la maggior parte dei risultati focalizzati sui segnalichimici 7,8. Più recentemente, i segnali meccanici sono stati indicati per svolgere un ruolo critico ma poco compreso nello sviluppo NCC9,10.
I segnali ambientali degli NCC svolgono un ruolo fondamentale durante il loro sviluppo, compresa la regolazione della differenziazione NCC in vari tipi di cellule. I segnali ambientali, ad esempio i segnali fisici, influenzano i comportamenti cardine e le risposte cellulari, come la diversificazione funzionale. La meccanotrasduzione consente alle cellule di percepire e rispondere a tali segnali per mantenere vari processi biologici2. Gli NCC sono circondati da cellule vicine e diversi substrati, come la matrice extracellulare (ECM), che può dare origine a stimoli meccanici per mantenere l'omeostasi e adattarsi ai cambiamenti attraverso la determinazione del destino, la proliferazione e l'apoptosi11. La meccanotrasduzione inizia alla membrana plasmatica dove si verifica la componente sensoriale degli stimoli meccanici extracellulari, con conseguente regolazione intracellulare della cellula12. Integrine, aderenze focali e giunzioni della membrana plasmatica relè segnali meccanici, come forze di taglio, stress e rigidità dei substrati circostanti, in segnali chimici per produrre risposte cellulari12. La trasmissione di segnali chimici dalla membrana plasmatica alla regolazione cellulare finale viene effettuata attraverso diverse vie di segnalazione per finalizzare i processi vitali per l'organismo, come la differenziazione.
Diversi studi hanno suggerito che la segnalazione meccanica dalla rigidità del substrato gioca un ruolo nella differenziazione cellulare13,14. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) cresciute su substrati molli con una rigidità simile a quella del tessuto cerebrale (nell'intervallo di 0,1-1,0 kPa) hanno determinato la differenziazione delle cellule neuronali15,16. Tuttavia, più MSC si differenziano in cellule simili ai miociti quando cresciute su substrati di 8-17 kPa che imitano la rigidità del muscolo, mentre la differenziazione simile agli osteoblasti è stata osservata quando le MSC sono state coltivate su substrati rigidi (25-40 kPa)15,16. Il significato della meccanotrasduzione è evidenziato dalle irregolarità e dalle anomalie nella via di segnalazione meccanica che potenzialmente portano a gravi difetti e malattie dello sviluppo, tra cui cancro, malattie cardiovascolari e osteoporosi17,18,19. Nei tumori, il tessuto mammario normale è morbido e il rischio di cancro al seno aumenta nel tessuto mammario rigido e denso, un ambiente che è più simile ai tumori al seno15. Con queste conoscenze, gli effetti della segnalazione meccanica sullo sviluppo di NCC possono essere studiati attraverso la semplice manipolazione della rigidità del substrato attraverso un sistema in vitro, fornendo ulteriori vantaggi e possibilità nella comprensione dei fondamenti della progressione della malattia correlata alla NC e dell'eziologia.
Per studiare l'impatto dei segnali meccanici negli NCC, abbiamo istituito un efficiente sistema in vitro per NCC basato sull'ottimizzazione di metodi precedentemente pubblicati e sulla valutazione delle risposte degli NCC a diversi segnali meccanici20,21. È stato fornito un protocollo dettagliato per la preparazione della rigidità dell'idrogel variabile e la valutazione dell'impatto della segnalazione meccanica negli NCC. Per raggiungere questo obiettivo, gli NCC O9-1 vengono utilizzati come modello NC per studiare gli effetti e i cambiamenti in risposta agli idrogel rigidi rispetto a quelli morbidi. Gli NCC O9-1 sono una linea cellulare NC stabile isolata dall'embrione di topo (E) al giorno 8.5. Gli NCC O9-1 imitano gli NCC in vivo perché possono differenziarsi in vari tipi di cellule derivate da NC in mezzi di differenziazione definiti22. Per studiare la segnalazione meccanica degli NCC, è stato fabbricato un substrato a matrice con elasticità sintonizzabile da concentrazioni variabili di soluzioni di acrilammide e bis-acrilammide per ottenere la rigidità desiderata, correlata alla rigidità del substrato biologico20,21,23. Per ottimizzare le condizioni del substrato matriciale per NCC, in particolare le celle O9-1, sono state apportate modifiche dal protocollo20precedentemente pubblicato. Una modifica apportata a questo protocollo è stata quella di incubare idrogel nel collagene I, diluito in acido acetico allo 0,2% invece di 50 mM HEPES, a 37 °C durante la notte. Il basso pH dell'acido acetico porta ad una distribuzione omogenea e ad una maggiore incorporazione di collagene I, consentendo così un attaccamento più uniforme della proteina ECM24. Inoltre, una combinazione di siero equino e siero bovino fetale (FBS) è stata utilizzata alle concentrazioni del 10% e del 5% rispettivamente nella soluzione salina tampone fosfato (PBS), prima di conservare gli idrogel nell'incubatrice. Il siero di cavallo è stato utilizzato come supplemento aggiuntivo a FBS grazie alla sua capacità di promuovere la proliferazione e la differenziazione cellulare alla concentrazione del 10%25.
Con questo metodo, un ambiente biologico è stato imitato dal rivestimento proteico ECM (ad esempio, Collagen I) per creare un ambiente in vitro accurato per far crescere e sopravvivere20,21. La rigidità degli idrogel preparati è stata analizzata quantitativamente tramite microscopia a forza atomica (AFM), una tecnica ben nota per rappresentare il modulo elastico26. Per studiare l'effetto di diversi livelli di rigidità sugli NCC, le cellule O9-1 wild-type sono state coltivate e preparate su idrogel per la colorazione di immunofluorescenza (IF) contro l'actina filamentosa (F-actina) per mostrare le differenze nell'adesione cellulare e nelle morfologie in risposta ai cambiamenti nella rigidità del substrato. Utilizzando questo sistema in vitro, i ricercatori saranno in grado di studiare i ruoli della segnalazione meccanica negli NCC e la sua interazione con altri segnali chimici per ottenere una comprensione più profonda della relazione tra NCC e segnalazione meccanica.

<table><tbody><tr><td>12 mm #1 Corning 0211 Vetrino coprioggetti</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-012</td><td></td></tr><tr><td>2% Bis-acrilammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662165</td><td></td></tr><tr><td>25 mm #1 Corning 0211 Vetrino coprioggetti</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-025</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropil trietossisilano (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 4 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>J61899-AP</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrilammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>50% glutaraldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>AFM cantilever (tallone sferico)</td> Software <td>Novascan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM</td><td>Catalizzatore NanoScope</td><td></td><td>Modello: 8.15 SR3R1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Falloidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td> <td>Sigma Aldrich 248614</td><td></td><td>Polvere</td></tr><tr><td>anti-AP-2 e alfa; Anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-12726</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Vinculina</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia a forza atomica (AFM) Bioscope Catalyst</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I (100mg)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometilsilano (DCMS)</td>Siero <td></td> d'asino <td>Sigma Aldrich</td> 440272 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>Aldrich D9663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Leica</td><td></td><td>Modello DMi8</td></tr><tr><td>Montaggio Fluoromount-G medio</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-35</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Corning</td><td>35-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>iScript Trascrizione inversa Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina antibiotico</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Acqua deionizzata sterile</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>U284</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472908</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema o9-1/hydrogel ottimizzato per lo studio dei segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Le cellule della cresta neurale (NCC) sono cellule multipotenti embrionali vertebrate che possono migrare e differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule che danno origine a vari organi e tessuti. La rigidità dei tessuti produce forza meccanica, un segnale fisico che svolge un ruolo fondamentale nella differenziazione NCC; tuttavia, il meccanismo rimane poco chiaro. Il metodo qui descritto fornisce informazioni dettagliate per la generazione ottimizzata di idrogel di poliacrilammide di varia rigidità, la misurazione accurata di tale rigidità e la valutazione dell'impatto dei segnali meccanici nelle celle O9-1, una linea NCC che imita gli NCC in vivo.
La rigidità dell'idrogel è stata misurata utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM) e ha indicato diversi livelli di rigidità di conseguenza. Gli NCC O9-1 coltivati su idrogel di varia rigidità hanno mostrato una diversa morfologia cellulare e l'espressione genica delle fibre da stress, che indicavano diversi effetti biologici causati da cambiamenti meccanici del segnale. Inoltre, questo ha stabilito che la variazione della rigidità dell'idrogel ha portato a un efficiente sistema in vitro per manipolare la segnalazione meccanica alterando la rigidità del gel e analizzando la regolazione molecolare e genetica negli NCC. Gli NCC O9-1 possono differenziarsi in una vasta gamma di tipi di cellule sotto l'influenza dei corrispondenti mezzi di differenziazione ed è conveniente manipolare i segnali chimici in vitro. Pertanto, questo sistema in vitro è un potente strumento per studiare il ruolo della segnalazione meccanica nelle NCC e la sua interazione con i segnali chimici, che aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi molecolari e genetici dello sviluppo e delle malattie della cresta neurale.

Preparazione dell'idrogel e valutazione della rigidità tramite AFM e modello Hertz Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per generare idrogel di poliacrilammide di rigidità variabile regolando il rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide. Tuttavia, gli idrogel di poliacrilammide non sono pronti per l'adesione delle cellule a causa della mancanza di proteine ECM. Pertanto, il sulfo-SANPAH, agendo come un linker, si lega covalentemente agli idrogel e reagisce con le ammine primarie delle protein...

Protocolli dettagliati passo-passo sono descritti qui per studiare i segnali meccanici in vitro utilizzando cellule multipotenti della cresta neurale O9-1 e idrogel di poliacrilammide di varia rigidità.

Un sistema O9-1/Hydrogel ottimizzato per lo studio dei segnali meccanici nelle cellule della cresta neurale

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Il metodo aiuta nello studio della segnalazione meccanica delle cellule della cresta neurale e della sua interazione con i segnali chimici. Può anche aiutare nei meccanismi molecolari e genetici dello sviluppo della cresta neurale nelle malattie. Trasferire gli slip di copertura in vetro è il più impegnativo quindi trasferirli lentamente e con attenzione per evitare di romperli e farli cadere.A dimostrare la procedura saremo io e la dottoressa Sherry Zhao, una borsista post-dottorato del mio laboratorio. Inizia posizionando il numero desiderato di coperchi di vetro su un pezzo di salvietta da laboratorio. Quindi sterilizzare ogni coperchio scivola facendolo passare avanti e indietro attraverso la fiamma del bruciatore di alcol.Quando il coperchio scivola si raffredda, coprire lo slittamento del coperchio da 12 millimetri con circa 200 microlitri e lo slittamento del coperchio da 25 millimetri con 800 microlitri di idrossido di sodio molare 0,1. Dopo cinque minuti, aspirare l'idrossido di sodio e lasciare asciugare all'aria il coperchio per cinque minuti per formare un film uniforme. Una volta asciugati i coperchi, aggiungere circa 18 microlitri di aminopropil trietossisilano o APTS su uno slittamento di copertura da 12 millimetri e 150 microlitri di APTS su uno slittamento di copertura da 25 millimetri.Aspirare l'accesso APTS per consentire all'APTS residuo di asciugarsi per cinque minuti. Successivamente, risciacquare le coperture scivola tre volte immergendole in acqua deionizzata sterile per cinque minuti ogni volta. Spostare il coperchio lavato scivola su una capsula di Petri fresca con il lato reattivo rivolto verso l'alto.E trattare le scivolate di copertura immergendo abbastanza 0,5% di glutaraldeide per 30 minuti. Dopo aver aspirato la glutaraldeide, sciacquare il coperchio scivola una volta con acqua deionizzata per tre minuti e asciugare all'aria il coperchio scivola con il lato reattivo verso l'alto. Per preparare gli slip di copertura siliconati, posizionare lo stesso numero di slip di copertura come quella copertina rivestita di aminosilano scivola in una capsula di Petri rivestita con para film.Quindi, trattare gli slittamenti di copertura da 12 millimetri con 40 microlitri e gli slittamenti di copertura da 25 millimetri con 150 microlitri di diclorometano silano o DCMS per cinque minuti. Lavare i vetri di copertura con acqua deionizzata sterile una volta per un minuto prima di posizionare gli slip reattivi del coperchio rivolti verso l'alto su una salvietta da laboratorio. Per preparare gli idrogel, pipettare la soluzione di gel di acrilammide appena preparata sugli slip di copertura rivestiti di aminosilano essiccato.Utilizzando una pinzetta curva, trasferire immediatamente il coperchio trattato con DCMS sulla parte superiore della soluzione di gel con il lato trattato che tocca la soluzione di gel, quindi inserire il sandwich della soluzione di gel tra due scivolate di copertura. Una volta che il gel è polimerizzato, separare il coperchio trattato DCMS scivolare con pinzette curve, lasciando scivolare il gel attaccato al coperchio rivestito di aminosilano. Quindi, immergere lo slittamento del coperchio da 12 millimetri con l'idrogel collegato in una piastra predeterminata a 4 pozzetti o 24 pozzetti coperta con 500 microlitri di PBS sterile o acqua deionizzata e il coperchio da 25 millimetri scivolare in una piastra a 6 pozzetti coperta con due millilitri di PBS sterile o acqua deionizzata per 30 minuti.Dopo aver rimosso la soluzione di acrilammide in eccesso, conservare gli idrogel in PBS sterile o acqua deionizzata a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, aspirare PBS o acqua deionizzata dalla piastra del pozzo prima di aggiungere soluzione di Sulfo-succinimydyl o Sulfo-SUNPAH per coprire completamente il gel. E posizionare i gel con la soluzione sotto una luce ultravioletta da 15 watt e 365 nanometri scoperta per 10 minuti.Raccogliere il più possibile il Sulfo-SANPAH per soluzione inclinando la piastra. E poi lavare il gel due o tre volte con 15 MILLIMOLARI HEPES. Aggiungere 15 milligrammi per millilitro collagene 1 diluito in acido acetico allo 0,2% a ciascun pozzo contenente l'idrogel.E incubare i gel durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, eseguire il lavaggio come descritto nel manoscritto prima di incubare gli idrogel con PBS contenenti il 10% di siero di cavallo e il 5% di FBS a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica. Dopo due ore di incubazione, aggiungere 500 microlitri di DMEM filtrato sterile con 10% FBS e 1% penicillina streptomicina a ciascun pozzetto e conservare i gel a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Quando la coltura cellulare è pronta, piastra circa 1,5 volte 10 alla quarta 09-1 cellule per centimetro quadrato nel mezzo bazell. Utilizzare una pinzetta per trasportare le scivolate di copertura su una nuova piastra per ridurre al minimo i falsi segnali provenienti dalle cellule cresciute direttamente sulla piastra. Quindi, fissare le cellule utilizzando 500 microlitri di paraformaldeide al 4% per 10 minuti prima di trattare le cellule con 500 microlitri dello 0,1% tritone X-100 a temperatura ambiente.Dopo 15 minuti, cammina le cellule con 250 microlitri di siero d'asino al 10%. Colorare le cellule per F-actina con felodipina ad una diluizione da 1 a 400 in 250 microlitri di siero d'asino al 10%, seguita da incubazione con DAPI per 10 minuti. Lavare le celle con PBS per due minuti prima di aggiungere da tre a quattro gocce di terreno di montaggio per ciascun pozzetto.Su un microscopio a fluorescenza, cattura le immagini di almeno tre fotogrammi casuali per campione di idrogel che producono canali singoli e uniti. Nella valutazione della rigidità dell'idrogel attraverso la microscopia a forza atomica o AFM, la pendenza della curva di forza era delicata per gli idrogel morbidi poiché la forza richiesta dalla sonda AFM era inferiore. Tuttavia, su idrogel rigidi, la pendenza generata era molto più ripida.Le misurazioni AFM sono state quindi utilizzate per calcolare la rigidità media degli idrogel dal modulo elastico di Young in kilopascal. Le caratteristiche di crescita delle cellule P19 e 09-1 sono state osservate in idrogel di controllo e 40 kilopascal di sistemi di controllo e gel modificati. Le cellule 09-1 cresciute sui sistemi gel originali hanno portato a un numero maggiore di cellule morte.Al contrario, le cellule 09-1 cresciute sui sistemi di gel modificati hanno mostrato una crescita cellulare sana e un sufficiente attaccamento al substrato di idrogel con un piccolo mazzo cellulare indicato da cellule rotonde minime. Le celle P19 placcate su entrambi i sistemi idrogel mostravano un eccesso di celle galleggianti rotonde e una mancanza di attacchi al substrato cellulare. La compatibilità delle cellule della cresta neurale o NCC con il sistema idrogel modificato è stata valutata mediante colorazione immunofluorescente per AP-2.È stato osservato un aumento significativo dell'espressione di AP-2 nelle cellule 09-1 placcate sul sistema idrogel modificato. Inoltre, le cellule 09-1 hanno mostrato morfologie diverse in base agli idrogel a bassa o alta rigidità attraverso quantità variabili di fibre di stress. L'espressione anti-vinculina nelle cellule 09-1 coltivate sull'idrogel da 40 kilopascal era superiore a quella coltivata sull'idrogel di un kilopascal, riflettendo che le cellule cresciute su substrati più morbidi formano complessi di addizione focale minimi rispetto al substrato rigido.Un tempo di attesa appropriato è fondamentale per la polimerizzazione degli idrogel poiché gli acrilammidi sono tossici per le cellule. Immergere gli idrogel in PBS o acqua deionizzata per almeno 30 minuti per garantire risultati migliori.

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