Test di rilascio del mediatore umanizzato come lettura per la potenza degli allergeni

Il test rappresenta un importante strumento di ricerca per simulare le degranulazioni dei basofili indotte dal cross-linking delle IgE dei pazienti e degli allergeni. Quindi il test può essere utilizzato per imitare il tipo 1, reazioni allergiche. Il test è robusto, riproducibile e personalizzabile.

Inoltre, è altamente sensibile in quanto può essere eseguito con piccole quantità di allergeni ricombinanti o purificati o anche con estratti allergenici complessi. Il metodo viene utilizzato per diagnosticare le allergie in quanto analizza la reattività delle IgE dei pazienti agli allergeni. Anche questo metodo è adatto per analizzare la cross-reattività e per monitorare l'efficacia del trattamento AIT.

Iniziare raccogliendo le cellule Ag8 dal pallone di coltura cellulare e trasferire le cellule in un tubo di centrifugazione. Pellet giù le celle per centrifugazione per cinque minuti, a 250 volte g a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risuspenare il pellet cellulare ad una concentrazione finale di circa una volta 10 alla sesta cella, per millilitro in cellule RBL umanizzate.

Diluire i sieri umani da uno a 10 in sospensione cellulare Ag8 per la diluizione sierica finale da uno a 20 nel test e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius e dal cinque al 7% di anidride carbonica. Quando le cellule RBL umanizzate raggiungono il 50-90% di confluenza, aspirare accuratamente il mezzo da un pallone di coltura cellulare T-75 senza toccare le cellule RBL umanizzate aderenti. Lavare le celle due volte aggiungendo 10 millilitri di DPBS sul lato opposto del pallone e non direttamente sulle celle.

Aspirare DPBS, aggiungere cinque millilitri di preriscaldato una volta tripsina-EDTA per il distacco cellulare e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Picchiettare delicatamente il pallone per staccare le cellule. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugazione da 15 millimetri e riempire il tubo con un mezzo cellulare RBL umanizzato o DPBS per diluire la tripsina-EDTA.

Centrifugare le celle a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risuscievole il pellet in cinque millilitri di mezzo cellulare RBL umanizzato per il conteggio cellulare. Dopo aver contato le cellule, diluire le cellule in mezzo cellulare RBL umanizzato per ottenere una concentrazione finale di due volte 10 alla sesta cella per millilitro.

Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare RBL umanizzata, per pozzetti, equivalenti a una volta 10 alle quinte cellule per pozzetti in una piastra sterile da 96 pozzetti. Centrifugare la sospensione sierica Ag8 pre incubata e trasferire 50 microlitri della sospensione sierica centrifuga Ag8 in ogni pozzo contenente cellule RBL umanizzate, senza disturbare il pellet cellulare Ag8. Utilizzare cellule sensibilizzate non stimolate senza antigene come nessun controllo dell'antigene per l'indicazione del plateau del segnale inferiore o dello sfondo e non sensibilizzare lo sfondo e i pozzetto di controllo della lisi massima.

Coprire la piastra con il coperchio e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e dal cinque al 7% di anidride carbonica. Aspirare i sieri contenenti il mezzo cellulare, invertire e picchiere la piastra sulla carta assorbente per svuotare la piastra per lavare le cellule RBL umanizzate. Lavare le cellule tre volte aggiungendo 200 microlitri del tampone di Tyrode per pozzo e incubare per circa 30 secondi per lavaggio per i primi due lavaggi.

Dopo aver aggiunto il tampone di Tyrode per la terza volta, aspirare il tampone e lasciare la soluzione nei pozzetti fino a quando non è pronta per aggiungere la diluizione dell'antigene. Trasferire 100 microlitri di soluzione antigenica in ogni pozzo contenente le cellule RBL umanizzate pre-sensibilizzate, ma non stimolare la massima lisi e le cellule di fondo non sensibilizzate con antigene. Aggiungere 100 microlitri del tampone di Tyrode nei pozzi di controllo della lisi massima, nei pozzetto di controllo dello sfondo non sensibilizzati e nei pozzetto senza antigene sensibilizzati.

Incubare le cellule per un'ora a 37 gradi Celsius e dal cinque al 7% di anidride carbonica. Trattare i pozzetti di controllo della lisi massima con 10 microlitri del 10% di Triton X-100 per pozzetto e mescolare correttamente per lisi completamente le cellule per il rilascio al 100% di beta-esosaminidasi. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di substrato in una nuova piastra a 96 pozzetti non vincolante.

Trasferire 50 microlitri di surnatante dai pozzi di cellule RBL umanizzate contenenti piastra nella nuova piastra contenente la soluzione di substrato e incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius per consentire la conversione del substrato fluorogenico. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto per pozzo e misurare la fluorescenza come descritto nel manoscritto di testo. La curva a campana ottenuta nel test di attività della beta-esosaminidasi, indica l'occupazione monovalente degli epitopi dell'antigene dell'immunoglobulina E dovuta all'eccesso di allergene, che inibisce la reticolazione dell'immunoglobulina E allergenica ad alte concentrazioni di antigene.

La concentrazione di antigene necessaria per il rilascio del mediatore semi-massimo è stata calcolata utilizzando l'analisi di regressione lineare. Il test di vitalità cellulare è stato eseguito per escludere gli effetti citotossici derivati dal siero sensibilizzante o dall'antigene utilizzato per la stimolazione. Cinque diversi sieri umani sono stati utilizzati per il test di attività della beta-esosaminidasi e quattro sieri su cinque derivati dall'allergia al polline di betulla hanno risposto alla stimolazione di Bet v 1, dimostrando che Bet v 1 è un potente allergene responsabile dei sintomi allergici mediati dall'immunoglobulina E.

È stata valutata la cross-reattività dell'immunoglobulina E agli allergeni omologhi. La risposta a Bet v 1 è stata trovata in entrambi i pazienti, ma anche il paziente due ha risposto a Cor a 1. L'allergene alimentare omologo Bet v 1, che indica livelli più elevati di immunoglobulina E cross-reattiva di Cor a 1 nel paziente due.

La natura ipoallergenica delle varianti mutanti degli allergeni è stata valutata e confrontata con la loro controparte wild type. La curva di rilascio della variante Bet v 1 fold si è spostata verso una concentrazione di antigene più elevata rispetto all'allergene wild type, con conseguente concentrazione significativamente più alta di antigene per provocare il rilascio mezzo massimo, che rende il mutante meno allergico e quindi un candidato per l'immunoterapia specifica dell'allergene. Non dimenticare di lasciare le soluzioni di lavaggio sulle cellule fino ad applicare la diluizione dell'antigene per evitare che le cellule si secchino, altrimenti ciò comporterebbe una scarsa esecuzione del test.

Il test può essere utilizzato per molte applicazioni diverse, tra cui la standardizzazione di prodotti allergenici, in base alla loro attività biologica, come soluzioni di prick test cutaneo o estratti utilizzati per l'immunoterapia specifica degli allergeni.