Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Ogni neurone nel cervello è collegato con altre cellule neuronali da circa 7.000 sinapsi. Tranne che quelle sinapsi nel cervello dei mammiferi si trovano principalmente sulle piccole sporgenze della membrana chiamate spine dendritiche. Plasticità delle sinapsi e spine dendritiche e simili, funzioni cerebrali così importanti come i processi di apprendimento e memoria.

È importante notare che solo la microscopia elettronica fornisce una visione completa se una colonna vertebrale dendritica ha un input postsinaptico. Sono disponibili varie tecniche sull'imaging delle spine dendritiche. Tuttavia, la microscopia elettronica a scansione frontale a blocchi seriali offre la possibilità unica di eseguire l'immagine di un grande volume di tessuto ad alta risoluzione.

La tecnica di microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi richiede uno speciale protocollo di preparazione del campione che comporta un forte contrasto con i metalli pesanti. La mia fissazione primaria durante la perfusione ci ha permesso di utilizzare lo stesso cervello per la microscopia elettronica alleggerito. I topi sono stati sacrificati e perfusi con un lieve fissativo primario.

Il cervello è stato tagliato a metà e un emisfero è stato fissato con immunofluorescenza dedicata fissativo, crioprotegginte, affettato usando un criostato ed elaborato per studi di immunofluorescenza. Dove l'altro emisfero è stato post fissato con la microscopia elettronica fissativa, affettato con il vibratoma e preparato per gli studi di microscopia elettronica. Le fette di cervello per gli studi di microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi sono state contrastate, piatte incorporate nella resina, quindi una regione CA1 dell'ippocampo è stata montata sul perno e tagliata con il microscopio elettronico a scansione seriale basato su blocchi.

La parte del protocollo evidenziata in una casella gialla è stata presentata nel video. Prendi il tessuto, che è stato fissato e tagliato in 100 fette microbiotiche e lavalo con tampone fosfato freddo cinque volte per tre minuti ciascuna. Preparare una miscela one-to-one di tetroxide di osmio 4% e ferrocianuro di potassio 3%.

Il prodotto finale diventerà marrone. Immergere i campioni in questa miscela. Quindi posizionare i campioni sul ghiaccio.

E da questa fase in poi è importante proteggerli dalla luce. Incubarli con un leggero scuotimento per un'ora. Nel frattempo, preparare la soluzione TCH.

Mescolare 10 millilitri di acqua doppia distillata e 0,1 grammi di TCH. Metterlo in un forno impostato a 60 gradi Celsius per un'ora. È importante swill la soluzione di volta in volta.

Quando è pronto, raffreddarlo a temperatura ambiente. Ora lavare i campioni con acqua doppia distillata cinque volte per tre minuti ciascuno e poi immergerli in soluzione TCH filtrata. Le fette diventerà nera.

Incubarli per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare i campioni con acqua doppia distillata cinque volte per tre minuti ciascuno e incubarli con tetrexide di osmio al 2% per 30 minuti, questa volta a temperatura ambiente. Ancora una volta, lavare i campioni con acqua doppia distillata cinque volte per tre minuti ciascuno e metterli in acetato di amile filtrato all'1% o amile.

Incubarli a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, inizia con la preparazione del D-aspartato. Mescolare il nitrato di piombo con la soluzione di acido aspartico preriscaldato a 60 gradi Celsius.

Posizionare la miscela a bagnomaria a 60 gradi Celsius e regolare il pH a 5,5 con un idrossido di sodio molare. Chiudere il flaconcino con aspartato di piombo e lasciarlo a 60 gradi Celsius per 30 minuti. La soluzione dovrebbe essere chiara.

Se diventa torbido deve essere scartato e ne deve essere preparato uno nuovo. Nel frattempo, lavare i campioni con il gas acqua doppia distillata cinque volte per tre minuti ciascuno e tenerli in forno a 60 gradi Celsius per 30 minuti. Immergere i campioni nella soluzione di aspartato di piombo appena preparata e incubarli nel forno impostato a 60 gradi Celsius per 20 minuti.

Preparare la resina epossidica. Pesare gli ingredienti e mescolare bene la resina per almeno 30 minuti prima di aggiungere l'acceleratore DMP 30. Preparare il virus con diluizione graduata di etanolo.

Quindi togliere i campioni dal forno e lavarli di nuovo con acqua doppia distillata cinque volte per tre minuti ciascuno. Nel frattempo, mescolare la resina con etanolo al 100% in proporzione uno a uno per ottenere la resina al 50%. Mescolare bene.

Successivamente, disidratare i campioni in ogni diluizione di etanolo per cinque minuti. Ricorda che i campioni non devono mai asciugarsi completamente. Infiltrare i campioni prima in resina al 50% per 30 minuti, poi in resina al 100% per un'ora e poi di nuovo in una resina fresca al 100% durante la notte.

Il giorno successivo, posizionare i campioni in resina fresca al 100% per un'ora e quindi incorporarli tra i fogli di incorporamento in fluoropolimero. Preparare pezzi di foglio di incorporamento che sono stati unti con etanolo e mettere da parte i vetrini che verranno utilizzati come supporto. Posizionare un pezzo di foglio di incorporamento su un vetrino, mettere una goccia di resina su di esso, quindi trasferire il campione con attenzione con l'uso di bastone di legno.

Coprilo con il secondo pezzo. Cerca di evitare le bolle d'aria. Sii gentile poiché il tessuto è molto fragile.

Posizionare con attenzione un altro vetrino sopra il pezzo di lamiera incorporato e polimerizzare il campione nel forno a 70 gradi Celsius per almeno 48 ore. Separare gli strati e tagliare un pezzo del campione incorporato con una lama di rasoio. Trasferiscilo in paraffina.

Ciò ridurrà al minimo il pericolo di perdere il campione a causa dell'elettrostatica. Prendi un perno di alluminio che è stato unto con etanolo. Mescolare bene una resina epossidica conduttiva e utilizzarne una piccola quantità per montare il campione sul perno.

Curare la resina epossidica conduttiva a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Tagliare ogni lato del blocco campione con il coltello diamantato e quindi lucidare la faccia del blocco fino a quando il tessuto non è esposto. Masare il campione sul perno usando vernice conduttiva e polimerizzarlo.

Per ridurre al minimo la carica, i campioni devono anche essere individuati rivestiti con un sottile strato di oro o palladio d'oro. Posizionare il perno con il campione nella camera del microscopio elettronico a scansione seriale a blocchi. Allineare il campione al coltello, quindi chiudere la camera e impostare i parametri.

Raccogli una pila di immagini. Utilizzando il metodo descritto, sono state ottenute immagini di tessuto cerebrale di topo. La grande immagine dell'ippocampo è stata presa in una regione e l'imaging è stato impostato al centro dello strato radiato.

È stata acquisita una pila di immagini e gli oggetti di interesse, come spine dendritiche e sinapsi, sono stati segmentati. La morfologia tissutale di buona qualità è stata ottenuta con membrane e vescicole sinaptiche chiaramente visibili e mitocondri ben conservati. Studi immunofluorescenti sull'anticorpo PSD 95 hanno confermato che la fissazione primaria lieve e la fissazione tradizionale con PFA al 4% danno risultati comparabili.

Il protocollo presentato consente l'acquisizione di immagini di tessuto cerebrale con l'uso di microscopia elettronica a scansione seriale basata su blocchi, morfologia tissutale di alta qualità e 12 membrane visibili facilitano 10 segmentazione e ricostruzione a destra. La mia fissazione primaria ha permesso di utilizzare gli stessi cervelli per l'analisi dell'immunofluorescenza PSD 95 e la microscopia elettronica che ha imaging delle spine dendritiche. Qui usiamo PSE 9, 500 in erba.

Tuttavia, anche l'altro può essere utilizzato.