Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda
23 settembre 2021
La trasformazione germinale di successo nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda,è stata ottenuta utilizzando l'mRNA della trasposasi iperattiva piggyBac.
Questo protocollo mostra la produzione di Fall Armyworm transgenico utilizzando il sistema di trasformazione basato su piggyBac. Speriamo che questi metodi possano beneficiare del miglioramento della trasformazione, non solo nel Fall Armyworm, ma anche negli insetti lepidotteri. Il metodo qui descritto rende efficiente la trasformazione germinale degli insetti parassiti lepidotteri.
A dimostrare la procedura sarà il Dr.Xien Chen, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Inizia mettendo 12 pupe maschili e 12 pupe femmine in una scatola. Mettere una soluzione di saccarosio al 10% nella scatola per l'alimentazione degli adulti.
Coprire la scatola con un tovagliolo di carta. Il secondo giorno dopo l'eclosione, esporre gli adulti a una luce intensa durante la notte. Il terzo giorno dopo l'eclosion, trasferisci gli adulti in un luogo buio.
Raccogli gli embrioni entro due ore dalla sovraposizione. Aggiungere gocce d'acqua al pezzo del tovagliolo di carta con uova fresche conservate in una capsula di Petri su ghiaccio. Trasferire delicatamente le uova su un vetrino con un pennello sottile e allinearle una ad una su una diapositiva di vetro.
Tenere i vetrini con le uova allineate sul ghiaccio prima della microiniezione. Iniettare una miscela di 200 nanogrammi per microlitro piggyBac che esprimono plasmide, 200 nanogrammi per microlitro iperattivo piggyBac traspososi mRNA e acqua distillata sterile nelle uova utilizzando la pressione di compensazione del microiniettore automatizzato. Mantenere le uova iniettate a 27 più o meno un grado Celsius, 60 più o meno 10% di umidità relativa fino alla schiusa.
Nutri le larve tratteggiate con una dieta artificiale e trasferisci ogni larva in una piccola tazza nella fase iniziale di cagliata e stella. Raccogli le pupe e metti circa 150 pupe femmine e 150 maschi in una gabbia. Appendere diversi pezzi di asciugamani di carta 30 centimetri per 15 centimetri di dimensione nella gabbia per raccogliere le uova.
Raccogliere gli asciugamani di carta con le uova ogni giorno e mantenere le uova in condizioni appropriate fino alla schiusa. Tenere le larve neonate a quattro gradi Celsius per cinque minuti per immobilizzarle, quindi trasferirle su una piastra ghiacciata. Schermare le larve neonate immobilizzate sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza.
Seleziona i neonati EGFP-positivi, sollevali allo stadio pupale, in circa due settimane a 27 più o meno un grado Celsius. L'mRNA iperattivo della trasposasi piggyBac sintetizzato in vitro è stato rilevato utilizzando un gel di agarosio all'1%. Gli embrioni iniettati con PDS non hanno mostrato il segnale EGFP, mentre gli embrioni iniettati con plasmide e piggyBac iperattivo che esprimono EGFP e gli embrioni iniettati con mRNA di trasposasi piggyBac hanno mostrato fluorescenza EGP, indicando che la costruzione di piggyBac ha avuto successo.
Le larve G1 ottenute da uova risultanti da un auto-incrocio di adulti G0 hanno mostrato un forte segnale EGFP. Un frammento contenente il promotore e il frammento EGFP è stato amplificato con successo utilizzando il DNA genomico isolato dalle larve EGFP-positive come modello. Tuttavia, lo stesso frammento non è stato rilevato quando il DNA genomico è stato isolato dalle larve selvatiche come modello.
Le uova per la microiniezione devono essere il più fresche possibile e devono essere sempre tenute sul ghiaccio prima della microiniezione per rallentarne lo sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per rispondere alle domande sulla genomica funzionale degli insetti nocivi e sviluppare metodi di controllo genetico per questo parassita globale.
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Panoramica
Questo studio illustra un protocollo per la trasformazione germinale di successo nella falsa armea della farfalla, Spodoptera frugiperda, utilizzando un sistema di trasformazione basato su piggyBac. Il metodo promette un'efficienza di trasformazione migliorata nei parassiti lepidotteri e potenzia la ricerca di genomica funzionale in questi organismi.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Ingegneria genetica negli insetti nocivi
- Tecniche di biologia trasformazionale
- Applicazioni della genomica funzionale
Sfondo
- La falsa polilla del mais è un parassita agricolo di notevole importanza.
- Il sistema di trasposone piggyBac è noto per l'efficienza nel trasferimento genico.
- Migliorare la trasformazione della linea germinale è fondamentale per le strategie di controllo dei parassiti.
Metodi Utilizzati
- Microiniezione di uova con plasmide piggyBac e mRNA
- Spodoptera frugiperda come modello biologico
- Microscopia a fluorescenza per lo screening di larve transgeniche
Risultati principali
- L'espressione riuscita di EGFP nelle larve transgeniche ha dimostrato la funzionalità del sistema piggyBac.
- L'espressione di EGFP è stata verificata mediante amplificazione del DNA genomico, distinguendo le larve transgeniche da quelle di tipo selvatico.
- La tecnica di trasformazione si è rivelata efficiente per la produzione di insetti parassiti geneticamente modificati.
Conclusioni
- Lo studio stabilisce un metodo robusto per la trasformazione della linea germinale in Spodoptera frugiperda.
- I risultati contribuiscono al progresso delle misure di controllo genetico dei parassiti agricoli.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Lo stabilimento di una trasformazione germinale efficiente in parassiti agricoli come la falsa arvicola permette la genomica funzionale per la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei processi di controllo dei parassiti. Questo protocollo supporta la fase iniziale della scoperta fornendo un sistema scalabile per indagare la funzione genica e valutare gli esiti fenotipici in un modello di insetto rilevante per la malattia. Una transgenesi riuscita facilita lo screening successivo e la scoperta di biomarcatori per strategie di gestione genetica dei parassiti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione funzionale dei geni dei parassiti per convalidare bersagli per strategie di controllo genetico.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per generare linee transgeniche per una valutazione costante dei bersagli.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica collegando l'interruzione genica a effetti fenotipici in un modello di parassita.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera linee con reporter fluorescenti per lo screening ad alto rendimento di perturbazioni genetiche.
- Valore operativo: Permette un genotipaggio standardizzato basato sulla PCR e la TAIL-PCR per la validazione del sito di inserzione.
- Prontezza per saggi: Produce ceppi transgenici stabili adatti allo screening di composti e a saggi fenotipici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la validazione genica nella fase di scoperta alla valutazione preclinica dei meccanismi di controllo genetico.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Permette la valutazione dell'essenzialità genica e dell'impatto fenotipico prima dell'applicazione sul campo.
- Allineamento dei Biomarcatori: Favorisce l'identificazione di marcatori genetici associati a tratti di suscettibilità o resistenza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo la validazione dell'obiettivo mediante trasgenesi, supportando l'identificazione dei composti promettenti attraverso lo screening fenotipico e informando le decisioni precliniche mediante modelli genetici stabili.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo l'interruzione genica o la sovraespressione nel verme orientale per valutare la rilevanza del bersaglio.
- Screening: Genera linee transgeniche standardizzate per lo screening riproducibile di modulatori genetici o chimici.
- Analisi: Fornisce letture quantitative tramite PCR e fluorescenza per misurare l'integrazione del transgene e i livelli di espressione.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta della funzione genica alla valutazione preclinica di approcci di controllo genetico dei parassiti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di trasgenesi riutilizzabile in diverse specie di parassiti lepidotteri per la validazione dei bersagli su tutta la linea di prodotti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione del bersaglio attraverso una manipolazione genetica diretta in un modello di parassita.
- Valore operativo: Fornisce un sistema di trasgenesi scalabile e riproducibile, con protocolli standardizzati di microiniezione e screening.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'incertezza biologica riguardo all'essenzialità del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sulla validazione fenotipica in vivo in un modello di parassita.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in embriologia degli insetti e tecniche di microiniezione.
- Necessita di microiniettore automatico, microscopio stereoscopico a fluorescenza e attrezzature per PCR per la validazione.
- Richiede protocolli standardizzati per la raccolta degli embrioni, le condizioni di iniezione e lo screening dei trasgenici tra diversi gruppi di lavoro.
- Richiede l'adattamento dei protocolli di temperatura, umidità e alimentazione per diverse specie di lepidotteri.
- Dipende dalla qualità e freschezza degli embrioni, con l'efficienza della microiniezione influenzata dal momento dello sviluppo.
