Name: Misurazione del turnover lipidico di membrana con lanalogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Impara a monitorare il turnover lipidico di membrana durante esocitosi e endocitosi utilizzando la sonda fluorescente ND6 sensibile al pH in neuroni vivi. Questo metodo fornisce misurazioni quantitative dirette della dinamica delle vescicole sinaptiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Florida Atlantic University Office of Undergraduate Research and Inquiry grant (M.J.S.), Florida Department of Health Ed and Ethel Moore Pilot Grant 20A17 (Q.Z.), Alzheimer's Association grant AARG-NTF-19-618710 (Q.Z.) e NIA R21 grant AG061656-01A1 (Q.Z.).

Il seguente protocollo include (1) una procedura semplificata per stabilire colture ippocampali e corticali di topo basate su un protocolloconsolidato 22, (2) una breve introduzione a una configurazione di microscopio a epifluorescenza per neuroni vivi, (3) una descrizione dettagliata del carico e dell'imaging di ND6 nei neuroni di topo, (4) una discussione sulla quantificazione del traffico di membrana da parte del segnale ND6. Tutte le procedure seguono le linee guida sulla biosicurezza e IACUC della Florida Atlantic University. La sintesi di ND6 è stata descritta in precedenza20.
1. Preparazione di colture ippocampali e corticali di topo
NOTA: Se non diversamente specificato, tutti i passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare di livello 2 di biosicurezza. Sterilizzare tutti gli strumenti e i materiali.
<ol><li>Utilizzare una pinza di misura 5 per posizionare i vetrini coprioggetti in piastre di coltura a più pozzetti. NOTA: Ad esempio, una piastra a 24 pozzetti è ideale per vetrini coprioggetti da 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> .</li>
	<li>Aggiungere il volume appropriato di matrici extracellulari per rivestire la superficie della coltura cellulare (ad esempio, 75 μL di soluzione di matrice di membrana basale per vetrino coprioggetto da 12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> ; vedere la tabella dei materiali)</li>
	<li>Posizionare le piastre preparate nell'incubatore per colture tissutali (5% di CO2, 100% di umidità e 37 °C) per 1-4 ore per consentire la reticolazione della matrice della membrana basale.</li>
	<li>Sacrificare gli animali, aprire il cranio e trasferire l'intero cervello in una capsula di Petri da 35 mm con 3 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente il 20% di siero fetale bovino (H+20). Taglia il cervello lungo la linea mediana e separa le cortecce e gli ippocampi in una cappa di dissezione a flusso laminare per ridurre la contaminazione.</li>
	<li>Utilizzare le microforbici per tagliare i fazzoletti in piccoli pezzi (~1 mm3). Trasferire questi tessuti in una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di H+20.</li>
	<li>Lavare i fazzoletti tre volte con 5 mL di H+20 e tre volte con 5 mL di HBSS.</li>
	<li>Aggiungere 1,5 mL di tripsina all'1% con acido etilendiammina tetraacetico e incubare a 37 °C per 10 minuti per la digestione enzimatica.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 1.6 e utilizzare il vuoto per aspirare HBSS alla fine.</li>
	<li>Dissociare meccanicamente i tessuti in 1 mL di HBSS contenente 2,95 g/L MgSO4•7H2O utilizzando una pipetta di vetro lucidato a fuoco.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 400 × g, 4 °C per 5 min.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno di coltura per ottenere una concentrazione di ~10.000.000 di cellule/ml.</li>
	<li>Placcare le cellule a ~1.000.000 di cellule/cm2 e posizionare la coltura nell'incubatore (5% di CO2, 100% di umidità e 37 °C) per 1-4 ore per facilitare l'attacco delle cellule ai vetrini coprioggetti.</li>
	<li>Aggiungere un volume appropriato di terreno di coltura (ad es. 1 mL per pozzetto per una piastra da 24 pozzetti). Aggiungere lo stesso volume di terreno di coltura dopo 1 settimana. Dopo 2 settimane, sostituire metà del terreno di coltura esistente con terreno fresco ogni settimana.</li>
</ol>2. Configurazione del microscopio per l'imaging a fluorescenza di cellule vive
NOTA: Una configurazione di imaging esemplare (Figura 5) include almeno un microscopio a fluorescenza invertito (vedere la Tabella dei materiali), una sorgente di luce a fluorescenza con otturatore automatico, set di filtri a fluorescenza (ad esempio, per l'imaging ND6, utilizzare 405/10 BP per l'eccitazione, 495 LP per la dicroica e 510/20 BP per l'emissione) e una fotocamera ad alta sensibilità (Tabella dei materiali), tutti controllati da un software di acquisizione delle immagini (Tabella dei materiali).
<ol><li>Preparare una camera di imaging che consenta il controllo della temperatura e l'ingresso/uscita della soluzione per l'imaging a fluorescenza di cellule vive. NOTA: Ad esempio, in questo protocollo è stata utilizzata una camera di imaging a bagno aperto modificata fissata su una piattaforma di riscaldamento (Figura 6).</li>
	<li>Impostare un dispositivo programmabile per commutare le soluzioni di perfusione e fornire lo stimolo elettrico in punti temporali definiti durante l'imaging. NOTA: La sincronizzazione hardware e software è necessaria per le analisi quantitative (Figura 7). Ad esempio, in questo protocollo, un'uscita trigger dalla fotocamera per immagini è stata utilizzata per avviare un programma per computer che controlla un dispositivo di commutazione automatica, che controlla un sistema di perfusione multicanale e uno stimolatore a impulsi quadrati.</li>
	<li>Per co-immagine di due o più reporter fluorescenti, eseguire l'imaging a fluorescenza multicanale commutando in sequenza i set di filtri o suddividendo simultaneamente diverse emissioni di fluorescenza e proiettando sulla stessa telecamera.</li>
</ol>3. Caricamento e imaging di ND6 in colture neuronali
<ol><li>Pesare una quantità adeguata di ND6, scioglierlo in dimetilsolfossido (DMSO) e lasciarlo solubilizzare a temperatura ambiente; sonicare brevemente (ad es. 3 min). Filtrare la soluzione madre grezza utilizzando un filtro da 0,22 μm per rimuovere gli aggregati coloranti di grandi dimensioni. Dopo la filtrazione, determinare la concentrazione del colorante mediante spettroscopia di assorbimento a 405 nm utilizzando uno spettrofotometro convenzionale o a microvolumi utilizzando ε = 10.700 M-1 cm-1.</li>
	<li>Prima dell'applicazione, diluire la soluzione madre a una concentrazione di 1 μM utilizzando la soluzione del bagno. Conservare la soluzione madre a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Marcatura di endosomi e vescicole sinaptiche<ol><li>Per marcare ubiquitariamente i compartimenti della membrana endocitosa come gli endosomi, aggiungere la soluzione madre ND6 (ad esempio, 1 mM in DMSO) al terreno di coltura alla concentrazione finale di 1 μM e incubare al 5% di CO2, al 100% di umidità e a 37 °C per 30 minuti. Per ridurre l'estensione della marcatura SV, sopprimere farmacologicamente l'attività neuronale spontanea. Ad esempio, utilizzare la tetrodotossina per bloccare i potenziali d'azione o l'acido 2,3-diosso-6-nitro-1,2,3,4-tetraidrobenzo[f]chinossalina-7-sulfonamide (NBQX) e l'acido D-(-)-2-ammino-5-fosfopentanoico (D-AP5) per inibire la trasmissione eccitatoria23.</li>
		<li>Per etichettare selettivamente le SV, utilizzare una stimolazione breve ma forte per evocare l'eso-/endocitosi presinaptica. Innanzitutto, trasferire il/i vetrino/i coprioggetti per coltura in una capsula di Petri da 35 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> contenente 2 mL di soluzione di Tyrode normale a temperatura ambiente. In secondo luogo, diluire la soluzione madre ND6 nella soluzione di tinodo ad alto K+ (90 mM KCl) alla concentrazione finale di 1 μM. In terzo luogo, sostituire la normale soluzione di Tyrode nella capsula di Petri con la soluzione di Tyrode ad alto contenuto di ND6 K+ e incubare a temperatura ambiente per 2 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire la coltura cellulare marcata con ND6 nella camera di imaging riempita con una soluzione di Tyrode normale preriscaldata contenente 10 μM NBQX e 10 μM D-AP5.</li>
	<li>Regolare la velocità di perfusione a ~0,2 mL/s (cioè 1 goccia al secondo) e avviare la perfusione della soluzione di Tyrode normale preriscaldata contenente NBQX e D-AP5 per rimuovere l'ND6 in eccesso nella coltura.</li>
	<li>Regola la messa a fuoco e individua il campo visivo appropriato contenente neuroni sani e ben distribuiti che portano neuriti collegati. Evitare le aree contenenti colloidi coloranti non risolti.</li>
	<li>Prova a eseguire l'imaging di cellule caricate con ND6 con tempi di esposizione diversi per identificare le migliori impostazioni di imaging. NOTA: Per ottenere il miglior tempo di esposizione, l'intensità di fluorescenza dei pixel più elevata nell'immagine risultante è circa la metà dell'intervallo di bit (ad esempio, per un'immagine a 16 bit, l'intervallo di bit è compreso tra 0 e 65.535), il che consentirà un ulteriore aumento della fluorescenza quando viene applicata la soluzione del bagno acido. Il tempo di esposizione selezionato deve essere utilizzato per tutte le immagini ND6.</li>
	<li>Impostare il protocollo di stimolazione e perfusione, l'intervallo di frame e la durata totale. Ad esempio, nel seguente protocollo, utilizzare una linea di base di 30 s, una stimolazione del campo elettrico di 10 s a 30 Hz, un recupero di 50 s, un recupero di 120 s 90 mM K+, un recupero di 60 s, una soluzione di Tyrode di 60 s con 50 mM di NH4Cl, una soluzione di Tyrode di 60 s a pH 5,5 e un intervallo di frame di 3 s.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dell'immagine accompagnata dalla stimolazione e dalla perfusione sincronizzate. Monitora la simulazione e lo scambio di soluzioni durante l'imaging.</li>
	<li>Interrompere la perfusione al termine dell'imaging, rimuovere il vetrino coprioggetti e pulire la camera di imaging per la prova successiva.</li>
</ol>4. Quantificazione del traffico di membrana mediante una variazione della fluorescenza ND6
<ol><li>Eseguire il backup e/o una copia elettronica di tutti i file immagine.</li>
	<li>Scegli un programma di analisi per l'estrazione dei dati, ad esempio un software di analisi delle immagini open source come ImageJ24 e/o FIJI25.</li>
	<li>Aprire o importare una pila di immagini nel programma di analisi.</li>
	<li>Imposta la prima immagine come riferimento e allinea il resto ad essa utilizzando funzioni/plugin come Rigid Registration26, che mitigherà gli artefatti dovuti alla deriva xy. Fare riferimento alla Figura 8 per immagini di esempio.</li>
	<li>Calcola la media di tutte le immagini acquisite durante i 30 secondi prima del basale per produrre un'immagine di riferimento. Salvare una copia di questa immagine per riferimento futuro.</li>
	<li>Impostare la soglia di intensità per generare un'immagine binaria dall'immagine mediata di base.</li>
	<li>Usa Watershed in ImageJ o funzioni simili in un altro programma per separare neuriti o cellule in connessione.</li>
	<li>Utilizzare la funzione Analizza particella con dimensioni dell'area e circolarità appropriate per sollecitare le regioni di interesse (ROI) corrispondenti a membrane cellulari, endosomi, lisosomi o boutoni sinaptici. Salva tutte le ROI selezionate.</li>
	<li>Selezionare quattro ROI in background nelle aree prive di celle all'interno del campo visivo.</li>
	<li>Misura l'intensità media dei pixel per ogni ROI in ogni fotogramma della pila di immagini ed esporta i risultati per l'analisi statistica.</li>
	<li>Calcola l'intensità media delle ROI di fondo come rumore di base, che verrà sottratto dalle intensità medie dei pixel per ogni ROI.</li>
	<li>Calcolare la media delle tre intensità medie più alte per ogni ROI selezionato durante l'applicazione della soluzione di pH 5,5 Tyrode per ottenere l'intensità massima di fluorescenza, definita come 100% per la normalizzazione.</li>
	<li>Calcolare la media delle tre intensità medie più basse per ogni ROI selezionato durante l'applicazione di 50 mM NH4Cl per impostare l'intensità minima di fluorescenza, definita come 0% per la normalizzazione.</li>
	<li>Calcola le variazioni relative della fluorescenza per ogni ROI in base alle sue intensità 0% e 100%. Ricava le variazioni medie della fluorescenza, la cinetica delle variazioni e altri valori/grafici dai singoli dati ROI.</li>
</ol>

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<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

I coloranti a base lipidica, come l'1,1′-diottadecil-3,3,3′,3′-tetrametilidautocarbocianina (DiI) e il perclorato di 3,3′-diottideciloxacarbocianina (DiO), sono stati a lungo utilizzati per illustrare la morfologia cellulare e tracciare i processi cellulari come le proiezioni assonali dei neuroni. I coloranti stirilici, come FM1-43, sono stati inventati e utilizzati con successo per lo studio dell'esocitosi34. A causa della loro bassa affinità di membrana, marcano selettivamente le vescicole endoc...

Il doppio strato lipidico è uno degli assemblaggi di biomolecole più comuni ed è indispensabile per tutte le cellule. All'esterno delle cellule, forma la membrana plasmatica che interfaccia le cellule e il loro ambiente; All'interno delle cellule, compartimenta vari organelli specializzati per le funzionalità designate. Piuttosto dinamiche che ferme, le membrane lipidiche sperimentano costantemente la fusione e la fissione, che media il trasporto di biomateriali, la riforma degli organelli, il cambiamento morfologico e la comunicazione cellulare. Indubbiamente, la membrana lipidica è la base fisica di quasi tutti i processi cellulari e la sua disfunzione svolge un ruolo cruciale in vari disturbi che vanno dal cancro1 al morbo di Alzheimer2. Sebbene le molecole lipidiche siano molto meno diversificate delle proteine, la ricerca sulle membrane finora è stata principalmente incentrata sulle proteine. Ad esempio, si sa molto di più sul macchinario proteico che sui lipidi nell'esocitosi 3,4,5. Inoltre, l'organizzazione, la distribuzione, la dinamica e l'omeostasi dei lipidi attraverso le membrane superficiali e intracellulari rimangono in gran parte inesplorate rispetto alle proteine di membrana6.
Ciò non sorprende in quanto le moderne tecniche di biologia molecolare, come la mutagenesi, forniscono un vantaggio metodologico per lo studio delle proteine piuttosto che dei lipidi. Ad esempio, la marcatura transgenica della proteina fluorescente verde sensibile al pH (nota anche come pHluorin) alle proteine vescicolari facilita la misurazione quantitativa della quantità e del tasso di turnover delle proteine vescicolari durante l'eso-/endocitosi 7,8,9. Tuttavia, è quasi impossibile modificare geneticamente i lipidi di membrana in vivo. Inoltre, le manipolazioni qualitative e persino quantitative delle quantità e delle distribuzioni delle proteine sono molto più fattibili di quelle dei lipidi10. Ciononostante, lipidi fluorescenti nativi e sintetici sono stati isolati e sviluppati per simulare lipidi endogeni di membrana in vitro e in vivo11. Un gruppo di lipidi fluorescenti ampiamente utilizzati sono i coloranti stirilici, ad esempio FM1-43, che mostrano una fluorescenza potenziata dalla membrana e sono un potente strumento nello studio del rilascio di vescicole sinaptiche (SV) nei neuroni12. Ultimamente, i coloranti lipidici sensibili all'ambiente sono stati inventati e ampiamente utilizzati come una nuova classe di reporter per studiare varie proprietà della membrana cellulare, tra cui il potenziale di membrana11, l'ordine di fase13 e la secrezione14.
È stata sviluppata una nuova classe di mimetici lipidici la cui fluorescenza è sia sensibile al pH (ad esempio, pHluorin) che sensibile alla membrana (ad esempio, FM1-43) per misurare direttamente la distribuzione dei lipidi nella membrana plasmatica e negli endosomi/lisosomi e il traffico lipidico durante l'eso-/endocitosi. A questo scopo sono stati selezionati i ben noti fluorofori solvatocromici che presentano caratteristiche push-pull dovute al trasferimento di carica intramolecolare. Tra i fluorofori solvatocromici esistenti, lo scaffold di 1,8-naftalimmide (ND) è relativamente facile da modificare, versatile per la marcatura ed è unico in fotofisica15 ed è stato quindi utilizzato in intercalatori di DNA, diodi organici emettitori di luce e sensori di biomolecole 16,17,18.
Il collegamento di un gruppo donatore di elettroni alla posizione C4 dello scaffold ND genera una struttura push-pull, che porta ad un aumento del momento di dipolo ridistribuendo la densità elettronica nello stato eccitato19,20. Un tale trasferimento di carica intramolecolare produce grandi rese quantistiche e spostamenti di Stokes, con conseguente fluorescenzaluminosa e stabile 21. Questo gruppo ha recentemente sviluppato una serie di analoghi lipidici solvatocromici basati sullo scaffold ND e li ha ottenuti con buone rese sintetiche20.
La caratterizzazione spettroscopica mostra che, tra questi prodotti, ND6 possiede le migliori proprietà di fluorescenza (Figura 1)20. In primo luogo, ha picchi di eccitazione ed emissione ben separati (cioè, ~ 400 nm e ~ 520 nm, rispettivamente, nella Figura 2A, B) rispetto ai fluorofori popolari come l'isotiocianato di fluoresceina, la rodamina o la GFP, rendendolo spettralmente separabile da loro e quindi utile per l'imaging multicolore. In secondo luogo, la fluorescenza ND6 mostra un aumento di oltre otto volte della sua fluorescenza in presenza di micelle (Figura 2C), suggerendo una forte dipendenza dalla membrana. Precedenti studi di imaging a fluorescenza su cellule vive con diversi tipi di cellule hanno mostrato un'eccellente colorazione della membrana con ND620. In terzo luogo, quando il pH della soluzione è diminuito da 7,5 (che si trova comunemente in ambienti extracellulari o citosolici) a 5,5 (che si trova comunemente negli endosomi e nei lisosomi), ND6 mostra un aumento di circa due volte della fluorescenza (Figura 2D), mostrando la sua sensibilità al pH. Inoltre, la simulazione della dinamica molecolare indica che ND6 si integra prontamente nel doppio strato lipidico con la sua impalcatura ND rivolta verso l'esterno della membrana e il residuo di piperazina che mostra forti interazioni con i gruppi di testa dei fosfolipidi (Figura 3). Nel complesso, queste caratteristiche rendono ND6 un analogo lipidico fluorescente ideale per visualizzare e misurare il turnover lipidico di membrana durante l'eso-/endocitosi.
Questo articolo presenta un metodo per studiare il tasso di turnover e la dinamica dei lipidi SV utilizzando neuroni ippocampali di topo in coltura. Stimolando i neuroni con soluzioni di tirodo ad alto K+, le SV e la membrana plasmatica sono state caricate con ND6 (Figura 4A,B). Successivamente, i neuroni sono stati ristimolati con diversi stimoli seguiti da soluzioni contenenti NH4Cl e pH 5,5 di Tyrode (Figura 4D). Questo protocollo facilita la misurazione quantitativa dei tassi di esocitosi ed endocitosi assemblati in diverse circostanze (Figura 4C).

<table><tbody><tr><td>Digidata 1440A Sistema di acquisizione dati</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Digidata 1440A</td><td>Per la stimolazione sincronizzata e lo scambio di soluzioni</td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura a doppio canale</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td>Per l'imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>OMEGA Scientific</td><td>FB-01</td><td>Per la produzione di soluzione H+20 utilizzata nella dissezione e nella coltura tissutale</td></tr><tr><td>Hamamatsu Flash4.0 sCOMS macchina fotografica</td><td>: Hamamatsu Inc.</td><td>C13440-20CU</td><td>telecamera ad alta sensibilità</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hank</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td>Per la produzione di soluzioni H+20 utilizzate nella dissezione e nella coltura dei tessuti</td></tr><tr><td>Piattaforma riscaldata</td><td>Warner Instruments</td><td>PH-1</td><td>Per l'imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Per la coltura dei tessuti</td></tr><tr><td>Tabella di isolamento dalle vibrazioni Micro-G</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>Per l'imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Micro-manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>NA</td><td>Per il controllo dell'acquisizione delle immagini</td></tr><tr><td>Riscaldatore di soluzioni in linea multilinea</td><td>Warner Instruments</td><td>SHM-6</td><td>Per l'imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus Medium</td><td>THermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Per la coltura dei tessuti</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Nikon Ti-E</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/B</td><td>Per imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Telecamera CMOS digitale ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu</td><td>C1340-20CU</td><td>Per l'imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Camera di perfusione</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>Per l'imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Sistema di perfusione con controllo valvolare a sei canali</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6</td><td>Per lo scambio di soluzioni</td></tr><tr><td>Stimolatore a impulsi quadrati</td><td>Grass Instrument</td><td>SD9</td><td>Per la stimolazione del campo elettrico</td></tr></tbody></table>

misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente nd6 sensibile al ph

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

L'eso-/endocitosi è un processo comune che media lo scambio di biomolecole tra le cellule e il loro ambiente e tra cellule diverse. Le cellule specializzate utilizzano questo processo per eseguire funzioni vitali del corpo come la secrezione di insulina dalle cellule β e il rilascio di neurotrasmettitori dalle sinapsi chimiche. A causa del suo significato fisiologico, l'eso-/endocitosi è stato uno degli argomenti più studiati in biologia cellulare. Sono stati sviluppati molti strumenti per studiare questo processo a livello genico e proteico, grazie ai quali si sa molto sul macchinario proteico che partecipa a questo processo. Tuttavia, sono stati sviluppati pochissimi metodi per misurare il turnover lipidico di membrana, che è la base fisica dell'eso-/endocitosi.
Questo articolo introduce una classe di nuovi analoghi lipidici fluorescenti che presentano fluorescenza pH-dipendente e dimostra il loro uso per tracciare il riciclaggio dei lipidi tra la membrana plasmatica e le vescicole secretorie. Aiutati da semplici manipolazioni del pH, questi analoghi consentono anche la quantificazione della distribuzione dei lipidi attraverso la superficie e i compartimenti intracellulari della membrana, nonché la misurazione del tasso di turnover lipidico durante l'eso-/endocitosi. Questi nuovi reporter lipidici saranno di grande interesse per vari campi di ricerca biologica come la biologia cellulare e le neuroscienze.

Le SV sono specializzate per il rilascio di neurotrasmettitori tramite eso-/endocitosi evocata27. Le SV hanno un lume altamente acido (cioè pH 5,5), che è l'ideale per ND6. Abbiamo usato un'elevata stimolazione K+ per evocare l'eso-/endocitosi SV al fine di consentire a ND6 di accedere a SV. Com'era prevedibile, dopo il carico sono comparsi punti fluorescenti di colore verde brillante lungo i processi neuronali (Figura 9A). Il profilo della linea mostrato n...

Questo protocollo presenta un metodo di imaging a fluorescenza che utilizza una classe di fluorofori lipidici sensibili al pH per monitorare il traffico della membrana lipidica durante l'esocitosi cellulare e il ciclo di endocitosi.

Misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

Questo protocollo descrive la caratterizzazione e l'applicazione di una nuova sonda lipidica fluorescente sensibile al pH, specifica per le membrane cellulari, che consente ai ricercatori di monitorare l'esodosi e l'endocitosi nelle cellule vive. La maggior parte dei precedenti reporter sulla proteina di membrana si basa sulla proteina di fluorescenza verde sensibile al pH, che è indiretta. Come mimetico lipidico, ND6 si integra nella membrana cellulare e quindi riporta fedelmente il traffico della membrana lipidica.La sonda ND6 diventa fluorescente solo se incorporata in un ambiente di membrana biologica. L'intensità di fluorescenza di quella sonda è correlata con la protonazione e la deprotonazione del gruppo di testa della piperazina. Pertanto, la fluorescenza è molto più forte a pH più basso.L'esocitosi e l'endocitosi sono processi ubiquitari alla base della secrezione e dell'assorbimento di molte molecole di segnalazione. Pertanto, ND6 può essere utilizzato per studiare alcune questioni fondamentali nella biologia cellulare e nelle scienze biomediche. A dimostrare la procedura saranno Haley, Oliver e Jonathan, studenti del mio laboratorio.Iniziare preparando una camera di imaging che consenta il controllo della temperatura e l'uscita di ingresso della soluzione per l'imaging a fluorescenza di cellule vive. Impostare un dispositivo programmabile per commutare le soluzioni di perfusione e fornire lo stimolo elettrico in punti temporali definiti durante l'imaging. Pesare una quantità appropriata di ND6.Scioglierlo in dimetilsolfossido e lasciarlo solubilizzare a temperatura ambiente. Quindi sonicare brevemente la soluzione. Filtrare la soluzione madre grezza utilizzando un filtro da 0,22 micrometri per rimuovere gli aggregati coloranti di grandi dimensioni.Utilizzando uno spettrofotometro convenzionale o a micro volumi, determinare la concentrazione di colorante a 405 nanometri. Prima dell'applicazione, diluire la soluzione madre a una concentrazione di un milligrammo per millilitro utilizzando la soluzione bagno. Conservare la soluzione madre a temperatura ambiente al buio.Aggiungere la soluzione madre ND6 al terreno di coltura alla concentrazione finale di un microgrammo per microlitro e incubarla per marcare ubiquitariamente i compartimenti della membrana endocitosa, come gli endosomi. Per ridurre l'estensione della marcatura delle vescicole sinaptiche, sopprimere farmacologicamente l'attività neuronale spontanea. Dopo aver etichettato selettivamente le vescicole sinaptiche come descritto nel manoscritto, montare il vetrino coprioggetto contenente le cellule nella camera di imaging.Collegare il sensore di temperatura, l'ingresso di perfusione e la punta del vuoto alla camera di imaging. Regolare la velocità di perfusione a circa 0,2 millilitri al secondo e avviare la perfusione della soluzione di tirolo normale preriscaldata contenente NBQX e DAP5 per rimuovere l'ND6 in eccesso nella coltura. Regolare la messa a fuoco e individuare il campo visivo appropriato contenente neuroni sani e ben distribuiti che portano neuriti collegati.Evitare le aree contenenti Dicolloidi irrisolti. Provare a eseguire l'imaging di cellule caricate con ND6 con tempi di esposizione diversi per identificare le migliori impostazioni di imaging. Imposta il protocollo di stimolazione e perfusione, l'intervallo di fotogrammi e la durata totale utilizzando le informazioni contenute nel manoscritto del testo.Avviare l'acquisizione dell'immagine accompagnata da stimolazione e perfusione sincronizzate. Monitorare la stimolazione e lo scambio di soluzioni durante l'imaging. Interrompere la perfusione al termine dell'imaging.Rimuovere il vetrino coprioggetto e pulire la camera di imaging per la prova successiva. Eseguire il backup e creare una copia elettronica di tutti i file di immagine. Scegli e apri il programma di analisi per l'estrazione dei dati.Aprire o importare una pila di immagini nel programma di analisi. Dopo aver generato una maschera binaria, utilizzare la funzione di analisi delle particelle con la dimensione dell'area e la circolarità appropriate per sollecitare le regioni di interesse, o ROI, corrispondenti alle membrane cellulari, agli endosomi, ai lisosomi o ai bouton sinaptici. Selezionare quattro ROI in background nelle aree prive di celle all'interno del campo visivo.Quindi salva tutte le ROI selezionate. Allinea tutti i fotogrammi all'interno delle pile di immagini time-lapse ND6. Impostare la prima immagine come riferimento e allineare il resto ad essa utilizzando la registrazione rigida, che ridurrà gli artefatti dovuti alla deriva XY.Quindi salva le pile di immagini allineate. Applica le ROI salvate a pile di immagini ND6 allineate. Misura l'intensità media dei pixel della fluorescenza ND6 per ogni ROI in ogni fotogramma della pila di immagini.Quindi esporta i risultati per l'analisi statistica. Calcola l'intensità media delle ROI di fondo per ottenere il rumore di base, che verrà sottratto da tutte le ROI selezionate. Calcolare la media delle tre intensità medie più alte per ogni ROI selezionato durante l'applicazione della soluzione di pH 5,5 per ottenere la massima intensità di fluorescenza, definita come 100% per la normalizzazione.Calcolare la media delle tre intensità medie più basse per ogni ROI selezionato durante l'applicazione di 50 millimolari di cloruro di ammonio per impostare l'intensità minima di fluorescenza, definita come 0% per la normalizzazione. Calcola le variazioni relative della fluorescenza per ogni ROI in base alle sue intensità 0% e 100%. Ricava le variazioni medie della fluorescenza, la cinetica delle variazioni e altri valori o grafici dai singoli dati ROI.I punti fluorescenti verde brillante lungo i processi neuronali erano visibili dopo aver caricato le cellule neuronali con ND6. Una forte correlazione tra le intensità di fluorescenza di ND6 e FM464 ha anche suggerito la colorazione delle vescicole sinaptiche da parte di ND6. È stata osservata una diminuzione della fluorescenza ND6 in risposta sia alla stimolazione elettrica che alla stimolazione ad alto contenuto di potassio, suggerendo che ND6 risiede nella membrana della vescicola sinaptica e che il lume della vescicola sinaptica viene neutralizzato durante il rilascio.Sotto un'esaustiva stimolazione elettrica, il trattamento con M beta CD ha ridotto significativamente il rilascio e il recupero delle vescicole sinaptiche misurate mediante imaging ND, il che ha suggerito che il colesterolo di membrana facilita l'esocitosi e l'endocitosi delle vescicole sinaptiche. Baf A1 ha impedito il recupero della fluorescenza ND6 dopo la stimolazione bloccando in modo acuto la riacidificazione delle vescicole sinaptiche recuperate. La conoscenza di base della microscopia a fluorescenza è un must.Un'attenta pianificazione delle condizioni fisiologiche per supportare l'imaging di cellule vive è molto importante. È fondamentale determinare con precisione la concentrazione della soluzione madre ND. Se possibile, misurare nuovamente la concentrazione della soluzione madre prima di ogni utilizzo.Si prega di tenerlo lontano dalla luce solare diretta per evitare lo sbiancamento della foto e la decomposizione della sonda.

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Questo protocollo descrive in dettaglio un test in vitro per misurare l'assorbimento lipidico cellulare nelle cellule endoteliali dopo stimolazione con analoghi fluorescenti BODIPY-C12 e BODIPY-C16 di acidi grassi saturi a catena lunga e molto lunga. Questo metodo è efficiente e adattabile ad altri tipi di cellule, offrendo un approccio utile per lo studio del metabolismo dei lipidi.

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Impara a monitorare il turnover lipidico di membrana durante esocitosi e endocitosi utilizzando la sonda fluorescente ND6 sensibile al pH in neuroni vivi. Questo metodo fornisce misurazioni quantitative dirette della dinamica delle vescicole sinaptiche.

Misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH

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