Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare l'estratto nucleare attivo dallo stadio larvale 4 C. elegans e visualizzare l'attività di trascrizione in un sistema in vitro .

Questo protocollo colma una lacuna tecnica per lo studio biochimico dei C.elegans e ne amplia l'utilità come organismo modello. Questa tecnica è sia semplice che robusta, consentendo un isolamento coerente dell'estratto nucleare di C.elegans funzionalmente attivo. Inizia posizionando gli animali L1 sincronizzati su 10 piastre contenenti mezzi di crescita di nematodi da 150 millimetri seminate con Escherichia coli OP50 e lascia che gli animali crescano per 48 ore a 20 gradi Celsius fino a raggiungere lo stadio L4.

Una volta preparati i tamponi ipotonici e ipertonici, pulire l'omogeneizzatore Balch inondando la camera di macinazione con il 70% di etanolo. Quindi risciacquare la camera con acqua deionizzata per rimuovere l'etanolo in eccesso. Inserire la sfera di carburo di tungsteno nella camera di macinazione.

Tappare le estremità della canna dell'omogeneizzatore Balch e fissare i tappi con le viti in dotazione. Quindi preparare cinque millilitri dei tamponi ipotonici e ipertonici completi per campione come descritto nel manoscritto di testo. Quindi riempire una siringa sterile da due millilitri con un millilitro di tampone ipotonico completo e lavare delicatamente la camera di macinazione dell'omogeneizzatore Balch, lasciando circa 500 microlitri di tampone ipotonico completo nella camera.

Conservare l'omogeneizzatore lavato sul ghiaccio e lasciarlo raffreddare per 30 minuti. Raccogliere gli animali L4 ben nutriti con tampone M9 in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare gli animali a 1.000 volte g per tre minuti. Rimuovere il surnatante e continuare a lavare il pellet animale fino a quando il surnatante non è chiaro.

Quindi lavare gli animali con tre millilitri di tampone ipotonico freddo e centrifugare di nuovo come dimostrato. Dopo aver rimosso il tampone ipotonico surnatante, aggiungere un millilitro di tampone ipotonico completo al pellet animale e trasferire la sospensione animale su una nuova siringa sterile da due millilitri. Per omogeneizzare gli animali tenuti sul ghiaccio, spingere delicatamente gli animali attraverso la camera di macinazione dell'omogeneizzatore Balch caricato con la palla di tungsteno.

Quindi raccogliere gli animali nella siringa e ripetere questa procedura 30 volte. Dopo 30 cicli di omogeneizzazione, raccogliere la massima sospensione animale dall'omogeneizzatore Balch e conservare la siringa con la punta posizionata verso il basso all'interno di un microtubo da 1,7 millilitri. Rimuovere la sfera di tungsteno e pulire la camera di macinazione con acqua deionizzata.

Asciugare e riportare la palla al rispettivo tubo etichettato. Quindi inserire la sfera di tungsteno con un diametro di 7,9880 millimetri e un distanza di 12 micrometri nella camera di macinazione e richiudere l'omogeneizzatore. Lavare nuovamente la camera di macinazione con un millilitro di tampone ipotonico completo ghiacciato.

Macinare la sospensione 25 volte come dimostrato. Trasferire la sospensione animale in un microtubo pulito da 1,7 millilitri e conservare la sospensione sul ghiaccio. Pellet giù i corpi animali e detriti per centrifugazione.

Pipettare 40 microlitri del surnatante a un tubo etichettato come frazione di ingresso e conservare la frazione sul ghiaccio. Trasferire il surnatante rimanente in un nuovo tubo da 1,7 millilitri senza disturbare il pellet e centrifugare per pellettare i nuclei. Quindi trasferire il surnatante senza disturbare i nuclei pellettati in un nuovo tubo da 1,7 millilitri etichettato come frazione citosolica.

Per lavare il pellet nucleico, aggiungere 500 microlitri di tampone ipotonico completo al pellet, sospendere il pellet e centrifugare a 4.000 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Alla fine della centrifugazione, risospese il pellet nucleare in 500 microlitri di tampone ipotonico completo fresco e nuovamente centrifugare il campione come dimostrato. Quindi sciogliere il pellet in 40 microlitri di tampone ipertonico completo.

Trasferire la sospensione nucleare in un nuovo tubo da 1,7 millilitri etichettato frazione nucleare e conservarla sul ghiaccio. Determinare la concentrazione proteica di tre frazioni utilizzando un kit di quantificazione fluorescente. Aliquotare le frazioni nucleari in tubi monouso contenenti sei microgrammi della proteina nucleare e congelare a scatto nel ghiaccio secco e nel bagno di etanolo.

Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. L'immagine rappresentativa del gel mostra i prodotti di trascrizione dell'estratto nucleare di larve di Caenorhabditis elegans L4 utilizzando il modello di DNA promotore CMV. Il successo dell'isolamento delle proteine nucleari attive ha portato a una banda di 132 coppie di basi dopo una trascrizione in vitro, e l'isolamento senza successo ha provocato una banda debole o l'assenza di una banda.

Ricordarsi di etichettare chiaramente i buffer completi. Tamponi inappropriati possono danneggiare la funzionalità delle proteine nucleari. Inoltre, mantenere l'omogeneizzatore ghiacciato per prevenire la denaturazione delle proteine.

Lo sviluppo di questa tecnica ha permesso ai ricercatori di misurare il tasso di trascrizione dell'RNA di C.elegans durante condizioni stressanti, dimostrando che il tasso di trascrizione dell'animale può cambiare a seconda delle condizioni ambientali.