Metodi rapidi ed enzimatici per l'amplificazione di modelli minimi e lineari per la prototipazione di proteine utilizzando sistemi privi di cellule
14 giugno 2021
Lo studio descrive un protocollo per la creazione di grandi quantità (μg-mg) di DNA per campagne di screening proteico da frammenti di geni sintetici senza clonazione o utilizzando cellule viventi. Il modello minimo viene digerito enzimaticamente e circolarizzato e quindi amplificato utilizzando l'amplificazione isotermica del cerchio di rotolamento. Le reazioni di espressione senza cellule potrebbero essere eseguite con il prodotto non purificato.
Questo protocollo è significativo perché descrive in dettaglio come generare rapidamente grandi quantità di modello di DNA da utilizzare in reazioni prive di cellule da un piccolo frammento di gene ricevuto da una struttura di sintesi. L'amplificazione del cerchio rotante può generare grandi quantità di DNA più velocemente rispetto alla clonazione tradizionale. Quindi supporta cicli di apprendimento dei test di progettazione a throughput più elevato da librerie di DNA sintetico.
Queste tecniche possono avere una grande variabilità intrinseca per i nuovi utenti a causa dei molti passaggi e dei piccoli volumi richiesti. Un'attenta attenzione dovrebbe essere data alla tecnica e la pratica rende perfetti. Per iniziare, aggiungi tutti i componenti da un kit PCR in un singolo tubo PCR.
Quindi aggiungere un microlitro del frammento di gene risospeso. Omogeneizzare delicatamente la miscela ruotando su un'impostazione media per cinque-10 secondi. Dopo aver programmato il termociclatore secondo il protocollo del produttore del kit, eseguire la PCR.
Al termine della PCR, utilizzare un kit di pulizia PCR per purificare il DNA dalla miscela di reazione. In un tubo da 1,5 millilitri, aggiungere il tampone di legame del DNA e il campione PCR con un rapporto di cinque a uno. Trasferire questa miscela nella colonna di centrifuga e centrifugare a 16.000 volte G per un minuto.
Scartare il flusso attraverso. Aggiungere 200 microlitri del tampone di lavaggio del DNA alla colonna e incubarlo a temperatura ambiente per un minuto. Centrifugare nuovamente la colonna ed eliminare il flusso attraverso.
Lavare la colonna ancora una volta con il tampone di lavaggio del DNA, come dimostrato. Dopo aver eliminato il flusso dal secondo lavaggio, rimuovere l'eventuale tampone rimanente centrifugando la colonna per altri uno o due minuti. Per eluire il DNA, trasferire la colonna in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.
Quindi aggiungere 46 microlitri di acqua a doppio distillato nella colonna. Dopo un'incubazione di un minuto, raccogliere il DNA nel tubo mediante centrifugazione. E quantificare il DNA purificato usando uno spettrofotometro.
Per digerire e circolarizzare il DNA, combinare cinque microlitri del tampone di reazione necessario, 20 unità dell'enzima di restrizione HindIII e 45 microlitri del DNA purificato in un tubo PCR. Usando una pipetta, omogeneizzare delicatamente questa miscela. Quindi incubarlo in un termociclatore per 15 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, il calore inattiva l'enzima HindIII incubando per 20 minuti a 80 gradi Celsius. Quindi aggiungere cinque microlitri di T4 Ligase buffer e 800 unità di T4 Ligase al DNA appena digerito. Dopo aver mescolato delicatamente con una pipetta, incubare la miscela per un'ora a 25 gradi Celsius per eseguire la reazione di circolarizzazione.
Una volta completata la reazione, purificare il DNA utilizzando un kit di pulizia PCR come dimostrato in precedenza. Quindi quantificare il DNA. Per eseguire l'amplificazione del cerchio di rotolamento, combinare tutti i componenti di reazione e un microlitro del modello di espressione circolare purificato in un unico tubo.
Omogeneizzare la miscela con una pipetta e aliquote 10 microlitri della miscela in quattro tubi separati. Incubare i tubi a 30 gradi Celsius per quattro-18 ore, quindi disattivare il calore dell'enzima incubando a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'inattivazione del calore, incoraggiare la condensa sul fondo del tubo incubando a 12 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi, diluire la soluzione risultante aggiungendo 15 microlitri di acqua a doppio distillato a ciascun tubo. Combinare il contenuto di ciascun tubo prima di purificare e quantificare il DNA come dimostrato in precedenza. Per eseguire la reazione senza cellule, aggiungere i vari componenti necessari in un tubo e diluire al volume finale desiderato con acqua a doppio distillato.
Mescolare accuratamente la soluzione pipettando metà della soluzione su e giù da 10 a 20 volte. Trasferire la miscela di reazione in aliquote da 15 microlitri nei pozzetti desiderati nella piastra di microtitolazione. Quindi sigillare la piastra con un film sigillante incolore per mantenere l'umidità e prevenire l'evaporazione.
Posizionare la piastra sigillata nel lettore di piastre e consentire alla reazione di procedere al completamento. Se si esprime il gene BPN della subtilisina utilizzando il sistema privo di cellule, aliquote 94 microlitri di acqua a doppio distillato e un microlitro di 10 PNA micromolari in una piastra a fondo piatto e incolore da 96 pozzetti. Quindi aggiungere cinque microlitri della reazione senza cellule completata e leggere la piastra utilizzando un lettore di piastre impostato per misurare l'assorbanza a 410 nanometri ogni 20 secondi per 10 minuti mantenendo una temperatura di 25 gradi Celsius.
L'espressione della Superfolder GFP nell'estratto di stella BL21 DE3 utilizzando solo 3 microlitri di DNA RCA non purificato in una reazione a 15 microlitri è paragonabile a quella del plasmide PJL1. Raddoppiare e triplicare le quantità di template sembra non offrire alcun beneficio evidente, suggerendo livelli già saturi del template a 3 microlitri per reazione. Al contrario, sembra esserci un vantaggio nell'aumentare la quantità di modello RCA quando si utilizza l'estratto di cellule di deformazione shuffle.
Le proteine che richiedono temperature più basse o tempi di piegatura più lunghi influenzano il tempo necessario per completare l'intero flusso di lavoro. Ad esempio, l'analisi della subtilisina dopo quattro ore di espressione porta a un risultato fallito, poiché quattro ore non sono sufficienti per la maturazione della subtilisina. Tuttavia, consentire alla reazione di continuare a 16 ore porta a livelli rilevabili di subtilisina.
Tutti i componenti devono essere ben miscelati affinché questo protocollo funzioni alla massima efficienza. Seguendo questi metodi, una vasta libreria di proteine candidate può essere generata sinteticamente e quindi espressa a resa sufficiente per la caratterizzazione. Questo metodo ha spianato la strada al nostro gruppo per sviluppare N C due sensori che possono funzionare in estratti cellulari, permettendoci di caratterizzare rapidamente la proteina prototipo.
Questo ci consentirà di iterare in modo più rapido e intelligente la progettazione proteica di nuovi bio catalizzatori e terapie.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per generare grandi quantità di DNA per lo screening delle proteine da frammenti di geni sintetici senza la necessità di clonazione o cellule vive. Il metodo utilizza l'amplificazione isotermica del cerchio rotante per produrre rapidamente modelli di DNA adatti per reazioni di espressione senza cellule.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biotecnologia
- Biologia Molecolare
- Ingegneria Genetica
Sfondo
- I metodi di clonazione tradizionali sono lunghi e laboriosi.
- I sistemi di espressione senza cellule offrono un'alternativa rapida per la produzione di proteine.
- L'amplificazione del cerchio rotante può generare efficientemente grandi quantità di DNA.
- La variabilità nelle tecniche può presentare sfide per i nuovi utenti.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo semplificato per la generazione di DNA.
- Migliorare il throughput nei cicli di design-build-test-learn.
- Ridurre la complessità della preparazione del DNA per le reazioni senza cellule.
Metodi utilizzati
- Digestione enzimatica di modelli minimi.
- Circolarizzazione dei frammenti di DNA.
- Amplificazione isotermica del cerchio rotante per l'amplificazione del DNA.
- Reazioni di espressione senza cellule utilizzando prodotti non purificati.
Principali risultati
- Generazione di successo di grandi quantità di DNA da piccoli frammenti di geni.
- Produzione di DNA più rapida rispetto ai metodi tradizionali.
- Importanza della tecnica e della pratica per i nuovi utenti.
- Facilitazione di un throughput più elevato nelle applicazioni di DNA sintetico.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo efficiente per la generazione di DNA.
- Supporta i progressi nella sintesi proteica senza cellule.
- L'esecuzione attenta del protocollo può minimizzare la variabilità.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Rapid enzymatic amplification of minimal, linear DNA templates enables accelerated protein prototyping in cell-free systems, reducing cycle times from gene synthesis to functional assay. This approach supports high-throughput design-build-test-learn workflows, critical for early-stage biopharma discovery and synthetic biology innovation. By bypassing traditional cloning and leveraging direct cell-free expression, teams can iterate on protein candidates with greater speed and flexibility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid generation and testing of protein variants from synthetic DNA libraries.
- Supports functional validation of novel targets without cell-based cloning constraints.
- Facilitates iterative optimization of protein design for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Provides microgram to milligram quantities of DNA template for scalable cell-free assays.
- Reduces preparation time, allowing faster assay standardization and reproducibility checks.
- Enables direct use of RCA products in screening workflows, minimizing purification steps.
Translational & Preclinical Research
- Accelerates prototyping of candidate biocatalysts and therapeutic proteins for downstream validation.
- Supports rapid characterization of protein function in disease-relevant cell-free systems.
- Improves continuity from synthetic gene design to preclinical protein evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of synthetic gene receipt and early protein function screening, bridging discovery biology and assay development. It is positioned to streamline workflows from gene synthesis through lead identification and preclinical prototyping.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling fast protein expression from minimal templates.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative DNA inputs for high-throughput cell-free assays.
- Analytics: Supports direct measurement of protein activity and expression levels from unpurified templates.
- Translational Research: Facilitates rapid transition from synthetic construct to functional protein for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for diverse protein prototyping needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein function and target engagement.
- Operational Value: Standardizes DNA preparation, reduces hands-on time, and enhances throughput.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces resource investment in early-stage candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling rapid, parallel evaluation of multiple constructs.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in PCR, enzymatic digestion, and isothermal amplification techniques.
- Needs access to thermocyclers, plate readers, and basic molecular biology infrastructure.
- Demands careful technique to minimize variability, especially for new users handling small volumes.
- Adaptable to various protein targets and cell-free systems with minimal protocol changes.
- Workflow efficiency may vary with protein folding requirements and assay maturation times.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Amplifying the Gene Fragment via PCR
2:21
Digestion and Circularization
3:28
Isothermal Rolling Circle Amplification (RCA)
4:28
Cell-free Reaction and Subtilisin Assay
5:41
Results: Protein Expression from the Rolling Circle Amplification (RCA) Templates Using Cell-Free Systems
6:49
Conclusion
