Name: Regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Scopri come quantificare la fagocitosi dei macrofagi regolata dalle cellule staminali mesenchimali utilizzando bioparticelle fluorescenti sensibili al pH. Questo metodo ad alta portata illumina i meccanismi di contatto cellulare nell'immunità innata.

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Questo lavoro è stato supportato dal meccanismo NSF Major Research Instrument nell'ambito dei numeri di sovvenzione 1626093 e 1919583.

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<li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

L'analisi della fagocitosi utilizzando bioparticelle coniugate ad un colorante sensibile al pH è uno strumento relativamente nuovo che si è dimostrato vantaggioso rispetto alle tradizionali particelle etichettate fluorescentmente12,19,20. Con le tradizionali particelle etichettate fluorescenti, è possibile solo l'analisi del punto finale. La rilevazione viene effettuata con microscopia fluorescente e/o spettrofluorometria dopo i...

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule progenitrici che danno origine a cellule del tessuto connettivo. Le MSC sono presenti nei tessuti dei mammiferi adulti e possono essere isolate dal midollo osseo1. A causa delle loro proprietà immunomodulatorie, queste cellule sono ampiamente studiate2. I primi studi si sono concentrati sulla regolazione MSC delle cellule T3,4,5,6 ma più recentemente, la loro regolazione delle cellule macrofagiche (MΦ), una delle principali componenti cellulari dell'immunità innata, ha ricevuto maggiore attenzione7,8,9,10,11,12,13,14 . L'importanza dell'interazione MSC-MΦ nel trattamento della malattia infiammatoria è sottolineata dal fatto che l'esaurimento dei monociti/macrofagi abroga gli effetti terapeutici della MSC nei modelli animali8. Qui, il focus è l'interazione di contatto cellulare dell'MSC con MΦ. MSC hanno la capacità di regolare il fenotipo di MΦ promuovendo il passaggio da risposte infiammatorie a anti-infiammatorie, portando ad attività di riparazione tissutale8,9,10,11, e molto è stato fatto per dimostrare questi meccanismi regolatori. In altre circostanze, MSC può supportare o esacerbare una risposta infiammatoria guidata da MΦ12,13 e migliorare l'attività fagocitica MΦ14,15. Tuttavia, vi è una mancanza critica di dati esistenti che identifichino i meccanismi e le condizioni in cui MSC regola l'attività fagocitica di MΦ.
MΦ hanno famiglie di recettori che riconoscono patogeni opsonizzati (anticorpi o complementi rivestiti) o non opsonizzati che portano alla fagocitosi16. L'attivazione e l'attività di quest'ultimo è meno ben studiata17. In un ambiente non infiammatorio in vitro, MSC migliora la fagocitosi MΦ di agenti patogeni non opsonizzati13. Tuttavia, il riconoscimento di patogeni non opsonizzati da parte di MΦ può essere ridotto dopo l'esposizione a un ambiente infiammatorio prodotto dai linfociti durante una risposta immunitaria adattativa. IFN-γ, rilasciato da cellule natural killer e linfociti effettori, ha un effetto inibitorio sulla fagocitosi MΦ di particelle non opsonizzate18. È stato sviluppato un modello di co-coltura per studiare i meccanismi di regolazione del contatto diretto MSC della fagocitosi MΦ. L'obiettivo dell'esperimento qui presentato è determinare se MSC regola la fagocitosi MΦ di agenti patogeni non opsonizzati dopo che MΦ è stato esposto a IFN-γ (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Micropiastra in polistirene nero a 96 pozzetti</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano allo 0,4%</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>15 mL e 50 mL Provette da centrifuga sterili in polipropilene conico</td><td>ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass a camera a 4 pozzetti con pozzetti non rimovibili</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico (100X)&nbsp; Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7 Sistema di imaging</td><td>Zeiss</td> Albumina sierica bovina <td></td><td></td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sollevatore cellulare</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi di coltura, coltura tissutale trattata, superficie 75&nbsp; cm2, collo inclinato, con cappuccio, filtrato</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Linea cellulare MSC di topo</td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>ThermoFisher</td> ad alto glucosio <td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, inattivato a calore</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>FisherScientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>Mouse M&Phi; Linea cellulare</td></tr><tr><td>LADMAC Linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>Le cellule LADMAC secernono il fattore stimolante le colonie fattore di crescita 1 (CSF-1).</td></tr><tr><td>Soluzione di imaging su cellule vive</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Bioparticelle coniugate</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>IFN murino ricombinante-&gamma;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti sottovuoto sterili monouso, 250 mL, 0,2 & micro; m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per siringhe sterili, 0,2 micrometri</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura trattate con colture tissutali, 100 mm x 20 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; quantificazione e imaging

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state tradizionalmente studiate per le loro proprietà rigenerative, ma più recentemente, le loro caratteristiche immunoregolatrici sono state in prima linea. Interagiscono e regolano l'attività delle cellule immunitarie. Il focus di questo studio è la regolazione MSC dell'attività fagocitica dei macrofagi. La fagocitosi dei macrofagi (MΦ) è una parte importante della risposta del sistema immunitario innato alle infezioni e i meccanismi attraverso i quali MSC modula questa risposta sono in fase di studio attivo. Qui viene presentato un metodo per studiare la fagocitosi MΦ di particelle di zimosan non opsonizzate coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH mentre sono in co-coltura con MSC. Man mano che l'attività fagocitica aumenta e le particelle di zimosane etichettate sono racchiuse nell'ambiente acido del fagolisiosoma, aumenta l'intensità di fluorescenza della molecola sensibile al pH. Con le opportune lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, l'attività fagocitica viene misurata utilizzando uno spettrofotometro fluorescente e i dati cinetici vengono presentati come cambiamenti nelle unità fluorescenti relative per un periodo di 70 minuti. Per supportare questi dati quantitativi, il cambiamento nell'attività fagocitica viene visualizzato utilizzando l'imaging dinamico. I risultati che utilizzano questo metodo dimostrano che quando in co-coltura, MSC migliora la fagocitosi MΦ dello zimosan non opsonizzato di MΦ trattato sia naïve che IFN-γ. Questi dati si aggiungono alle attuali conoscenze sulla regolazione MSC del sistema immunitario innato. Questo metodo può essere applicato in indagini future per delineare completamente i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti.

Dopo aver calcolato la ± SEM media per ciascun gruppo in tutti i punti temporali, i dati vengono presentati in formato grafico a linee con l'asse Y come intensità fluorescente relativa e l'asse X come tempo. Il file supplementare 1 fornisce un esempio di dati grezzi da una lettura cinetica della piastra a 96 pozzetti in formato foglio di calcolo.
In questo studio, i risultati ottimali presentati in Figura 3Ae Tabella 3 dimostrano ...

Qui viene presentato un protocollo per quantificare e produrre immagini dinamiche della regolazione mediata da cellule staminali mesenchimali (MSC) della fagocitosi macrofagica (MΦ) di particelle di lievito non opsonizzato (zymosan) coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH.

Regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Questo metodo di co-coltura aiuterà a rispondere alle domande chiave che circondano i meccanismi di contatto cellulare alla base della regolazione delle cellule staminali mesenchimali della fagocitosi dei macrofagi e quindi illuminerà il ruolo di MSC nella regolazione dell'immunità innata. Questa tecnica può essere applicata in analisi ad alto rendimento. Le bioparticelle coniugate a coloranti sensibili al pH fluoresce solo in ambienti fagolisiosomi acidi.Quindi, il lavaggio e la tempra sono necessari. Questo metodo può anche essere applicato a una varietà di modelli di co-coltura che includono neutrofili e altri fagociti. A dimostrare la procedura sarà Ethan Chetkof, uno studente universitario attualmente nel mio laboratorio.Per cominciare, osserva la confluenza delle cellule staminali mesenchimali in coltura. Quando si raggiunge una confluenza del 70-80%, aspirare il mezzo di crescita dalle cellule coltivate in un piatto da 100 millimetri e aggiungere cinque millilitri di PBS. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere due millilitri di soluzione di TRIPSINA EDTA allo 0,05% e incubare le cellule per tre minuti.Dopo tre minuti, controllare il distacco cellulare utilizzando un microscopio invertito. E se le cellule non sono staccate, incubare di nuovo per uno o due minuti. Una volta che tutte le cellule sono staccate, aggiungere cinque millilitri di terreno di crescita fresco al piatto.Dopo aver risciacquato la piastra utilizzando la miscela di media tripsina, utilizzare una pipetta sierologica sterile per raccogliere le cellule in un tubo conico pulito e sterile da 50 millilitro. Successivamente, pellet giù le celle per centrifugazione. Dopo aver aspirato il surnatante, risuscievole il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno di coltura fresco tubando delicatamente su e giù.Per il conteggio delle cellule, aggiungere 10 microlitri di sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 30 microlitri di soluzione di Trypan Blue allo 0,4%, quindi aggiungere 10 microlitri della miscela sotto il coperchio di una camera di conteggio dell'emocitometro. Sotto il microscopio invertito o Brightfield, contare le cellule vitali non macchiate usando una lente obiettivo 10X e quattro camere millimetriche di un quadrato e calcolare il numero di cellule come descritto nel manoscritto di testo. Utilizzare l'equazione C1V1 uguale a C2V2 per determinare il volume desiderato del mezzo fresco e della sospensione cellulare necessaria per preparare la sospensione cellulare a una concentrazione finale di una volta 10 alla quinta cella per millilitro.Utilizzare un micropipetter multicanale per aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti in base al design della piastra. Utilizzare una micropipetta per aggiungere 530 microlitri della sospensione cellulare a ciascuno dei vetrini della camera in base al design della piastra e incubare durante la notte. Preparare 10 millilitri di mezzo di attivazione contenente interferone gamma ad una concentrazione di 250 nanogrammi per millilitro per attivare le cellule macrofagiche in un piatto da 100 millimetri.Aspirare il mezzo di crescita dalle colture cellulari dei macrofagi e risciacquare le cellule con cinque millilitri del mezzo di attivazione privo di interferone gamma. Dopo aver aspirato il mezzo di risciacquo nel piatto sperimentale, aggiungere 10 millilitri di mezzo di attivazione integrato con interferone gamma. E nella parabola di controllo, aggiungere 10 millilitri di mezzo di attivazione senza interferone gamma, quindi incubare le cellule per 16-24 ore.Alla fine dell'incubazione, per preparare le co-colture, rimuovere il mezzo di attivazione dalle cellule dei macrofagi e aggiungere cinque millilitri di terreno di crescita fresco. Utilizzare un sollevatore di celle per raschiare delicatamente le cellule e raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 millilitro. Successivamente, contare le cellule utilizzando l'esclusione e l'emocitometria di Trypan Blue, seguite dalla preparazione di sospensioni di cellule macrofagiche di controllo e trattate alla concentrazione di due volte 10 alla quinta cellula per millilitro come dimostrato in precedenza per le cellule staminali mesenchimali.Aspirare delicatamente il mezzo dai pozzi sperimentali contenenti cellule staminali mesenchimali. Utilizzare una micropipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri delle sospensioni cellulari macrofagiche trattate e di controllo nei pozzetti sperimentali appropriati secondo il design della piastra e incubare durante la notte come dimostrato. Aspirare delicatamente il mezzo dal vetrino a camera a quattro pareti contenente cellule staminali mesenchimali.Utilizzare una micropipetta per aggiungere 530 microlitri della sospensione cellulare dei macrofagi ai pozzeggi appropriati in base al design e incubare durante la notte. Aggiungere un millilitro di mezzo di imaging a cellule vive al flaconcino contenente un milligrammo di particelle Zymosan e raccogliere la miscela di particelle medie in un tubo di coltura di vetro. Dopo aver risciacquato il flaconcino con un ulteriore millilitro di soluzione di imaging, trasferire il mezzo di imaging risciacquato nel tubo di vetro, quindi aggiungere tre millilitri di soluzione di imaging aggiuntiva per ottenere 0,2 milligrammi per millilitro di sospensione di particelle Zymosan.Vortex la sospensione Zymosan utilizzando impulsi rapidi per 30-60 secondi, quindi utilizzare un sonicatore a sonda per sonicare la sospensione con 60 impulsi rapidi. Dopo aver aspirato il mezzo, risciacquare i pozzi sperimentali e i pozzi vuoti reagenti con 100 microlitri di soluzione di imaging a cellule vive. Quindi, aspirare la soluzione di imaging a cellule vive dai pozzi e aggiungere 100 microlitri della sospensione di Zymosan.Aprire il vassoio della piastra del lettore fluorescente utilizzando l'interfaccia touch pad. Impostare la piastra senza coperchio nel vassoio con il pozzetti A1 nell'angolo in alto a sinistra. Chiudi il vassoio usando il touch pad e fai clic sul pulsante di lettura verde nel menu in alto.Per condurre il test di fagocitosi, dopo aver risciacquato il primo pozzo sperimentale con 750 microlitri del mezzo di imaging, aggiungere 400 microlitri della sospensione di Zymosan lasciando i restanti pozzi nel terreno di crescita. Quindi, posizionare la diapositiva sullo stadio incubato del sistema di imaging. Utilizzare il software di imaging.Selezionare l'opzione Brightfield nella scheda Individua, quindi fare clic sull'icona dell'oculare. Con l'obiettivo 10X in posizione, utilizzare l'oculare e la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule. Selezionare la scheda acquisizione.Apri il menu a discesa dell'esperimento e seleziona una serie di lunghezze d'onda che include il set di filtri EGFP per ospitare l'eccitazione di 509 nanometri e le lunghezze d'onda di emissione di 533 nanometri del colorante sensibile al pH. Quando rimangono circa due minuti sul timer, fare clic sull'icona 20X nel menu obiettivo per cambiare l'obiettivo in 20X, quindi fare clic sul menu dei canali, selezionare filtri EGFP e, nel menu di esposizione, impostare il tempo di esposizione su 400 millisecondi per rilevare il fluoroforo verde sensibile al pH, quindi fare clic su live. Dopo aver regolato la messa a fuoco, fare clic su Stop per spegnere la luce e selezionare la casella accanto all'impostazione sperimentale time-lapse superiore.Nel menu della strategia di messa a fuoco, selezionare la messa a fuoco automatica del software e dal menu a discesa, selezionare le impostazioni smart e core per ridurre il tempo di esposizione alla luce mentre la messa a fuoco automatica è in esecuzione. Nel menu time-lapse, impostare il numero desiderato di acquisizioni su 30 a 60, il tempo di intervallo su un minuto, quindi fare clic sul pulsante Avvia esperimento per iniziare l'acquisizione. È stato studiato l'effetto dell'interferone gamma sulla co-coltura.I risultati rappresentativi dimostrano che la co-coltura di macrofagi con cellule staminali mesenchimali migliora l'attività fagocitica del macrofago. Il trattamento con interferone gamma riduce l'attività del macrofago. Tuttavia, in presenza di cellule staminali mesenchimali, l'attività fagocitica dei macrofagi è stata parzialmente salvata.Le densità cellulari ottimali sono fondamentali in questi studi. E quando le cellule dei macrofagi sono state placcate a una densità troppo bassa, non sono stati rilevati cambiamenti nell'intensità della fluorescenza. Quando le cellule dei macrofagi sono state placcate ad alta densità, l'intensità della fluorescenza è stata elevata rapidamente in tutti i gruppi e le differenze non sono state individuate.Una delle cose più importanti durante questa procedura è garantire che le densità cellulari siano ottimizzate e mantenute coerenti tra gli esperimenti.

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Un nuovo metodo per ottenere i macrofagi da colture primarie di cellule di fegato di ratto è descritto. Questo metodo utilizza la proliferazione dei macrofagi nella cultura, seguita da agitazione di palloni cultura e la purificazione di attaccamento selettivo ai piatti di plastica. Questa tecnica fornisce in modo efficiente i macrofagi del fegato, senza attrezzature complesse e competenze.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Questo video mostra un test per studiare la regolazione della fagocitosi dei macrofagi da parte delle cellule staminali mesenchimali (MSC) in una co-coltura. Dopo la co-coltura di MSC con macrofagi, vengono aggiunte particelle di zimoso non opsonizzate coniugate a un fluoroforo sensibile al pH che vengono fagocitate dai macrofagi. Con l'aumento della fagocitosi, l'intensità della fluorescenza aumenta, consentendo la determinazione della regolazione dell'attività fagocitaria mediata dalle MSC.

Un test per studiare la regolazione della fagocitosi dei macrofagi da parte delle cellule staminali mesenchimali

L'articolo descrive un semplice facilmente...

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

Vi presentiamo metodi per valutare la capacità fagocitica di primari macrofagi murini derivate da midollo osseo, utilizzando residui del myelin fluorescente contrassegnati e lipido intracellulare gocciolina macchiatura.

In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo

Qui presentiamo un protocollo per quantificare l'attività chemiotattica dei monociti del sangue nei modelli murini, per valutare gli effetti degli interventi nutrizionali, farmacologici e genetici sul monocito del sangue e per caratterizzare i monociti del sangue derivati dai macrofagi in modelli murini che utilizzano tappi di gel derivati dalla membrana del basato monocite-chemoattractant-1 (MCP-1).

Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Questo protocollo descrive la robusta generazione di macrofagi da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e metodi per la loro successiva caratterizzazione. L'espressione del marcatore di superficie cellulare, l'espressione genica e i saggi funzionali vengono utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione di questi macrofagi derivati da iPSC.

Produzione e caratterizzazione di macrofagi umani da cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo fornisce un metodo per digerire interi occhi in una singola sospensione cellulare ai fini dell'analisi citometrica del flusso multi-parametro al fine di identificare specifiche popolazioni fagocitiche mononucleari oculari, inclusi monociti, microglia, macrofagi e cellule dendritiche.

Digestione di interi occhi di topo per l'analisi citometrica a flusso multi-parametro dei fagociti mononucleari

Le malattie neurodegenerative sono associate a funzioni microglia disregolate. Questo articolo delinea un test in vitro della fagocitosi delle cellule di neuroblastoma da parte dei macrofagi iPSC. Le lettura quantitative al microscopio sono descritte sia per l'imaging time-lapse a cellule vive che per l'imaging ad alto contenuto a cellule fisse.

Test di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte del neuroblastoma da parte di iPSC-Macrophages

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Scopri come quantificare la fagocitosi dei macrofagi regolata dalle cellule staminali mesenchimali utilizzando bioparticelle fluorescenti sensibili al pH. Questo metodo ad alta portata illumina i meccanismi di contatto cellulare nell'immunità innata.

Regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging

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