Sistema di perfusione polmonare isolato nel modello di coniglio
15 luglio 2021
La preparazione polmonare di coniglio isolata è uno strumento gold standard nella ricerca polmonare. Questa pubblicazione si propone di descrivere la tecnica sviluppata per lo studio dei meccanismi fisiologici e patologici coinvolti nella reattività delle vie aeree, nella conservazione polmonare e nella ricerca preclinica nel trapianto di polmone e nell'edema polmonare.
Questa tecnica è utile nella caratterizzazione della fisiologia e della patologia polmonare misurando le attività metaboliche e la funzione respiratoria. Il sistema di perfusione polmonare isolato permette di lavorare con un organo funzionale completo rendendo possibile lo studio di una funzione fisiologica continua durante la ricreazione della ventilazione e della perfusione. Questo metodo potrebbe fornire informazioni sulla caratterizzazione delle capacità non respiratorie dei tessuti polmonari, come l'attività metabolica e le attività di vari componenti come il macrofago alveolare e il tessuto endoteliale.
Per cominciare, assemblare l'apparecchio di lavoro, assicurandosi che contenga la colonna principale in acciaio montata su una piastra di base che tiene il torace artificiale con lo pneumotachometro e il trasduttore di peso situati sopra la colonna e dietro la bobina di preriscaldamento con una trappola a bolle. Collegare tutti i trasduttori all'unità elettronica centrale e preparare il sistema di ventilazione oltre all'apparecchio. Dopo aver rasato il sito chirurgico del coniglio anestetizzato, fare un'incisione della linea mediana ventrale da tre a cinque centimetri dal manubrio dello sterno fino al collo.
Utilizzare le forbici operative per tagliare i 2/3 anteriori della trachea tra gli anelli cartilaginei. Inserire una cannula tracheale di cinque millimetri attraverso la membrana fibrosa tracheale e fissare con cura la cannula con una sutura di seta 4-0. Posizionare la pinza o la pinzetta sotto la trachea per assicurarsi che la cannula non si pieghi contro la trachea.
Collegare la pompa respiratoria alla cannula tracheale, impostare il volume di marea a 10 millilitri per chilogrammo e avviare rapidamente la ventilazione dopo la tracheotomia e prima che il torace venga aperto per mantenere la pressione positiva nei polmoni per prevenire il collasso polmonare durante l'intervento chirurgico. Per accedere alla cavità toracica, utilizzare un bisturi o forbici per aprire la parete toracica ed eseguire una sternotomia mediale fino al terzo superiore del torace. Tenere le metà del torace aperte con due riavvolgitori.
Localizzare la vena cava superiore e inferiore e taggarle con fili. Prima del dissanguamento dell'animale, identificare il ventricolo destro e iniettare 1.000 unità internazionali per chilogrammo di eparina. Subito dopo l'iniezione, ligare la vena cava superiore e inferiore con il filo pre-looped.
Tagliare il manubrium sterni per estendere la sternotomia mediale verso la cannula tracheale, rilasciando la trachea su entrambi i lati dal tessuto di collegamento. Ora resecare la trachea sopra la cannula tracheale e tirare delicatamente su la cannula in un asse cranico / caudale. Dopo il dissanguamento per la raccolta del blocco cardiopolmonare, utilizzare la dissezione digitale diretta o le forbici a molla per separare il tessuto connettivo e rimuovere i polmoni dal torace.
Quindi, sezionare la vascolarizzazione e l'esofago. Sollevare i polmoni isolati dal torace e posizionare con cura i polmoni su una garza sterile su una capsula di Petri. Per prevenire l'atelettasia, ventilare i polmoni utilizzando la ventilazione a pressione positiva con pressione espiratoria finale positiva impostata a due centimetri di colonna d'acqua.
Tagliare i ventricoli dal cuore a livello del solco atrioventricolare. Dopo aver aperto i due ventricoli, introdurre la cannula dell'arteria polmonare attraverso l'arteria polmonare destra e la cannula dell'atrio sinistro attraverso la valvola mitrale nell'atrio sinistro. Fissare le cannule con una sutura di seta 4-0 compresi i tessuti circostanti nelle legature dell'arteria polmonare e dell'atrio sinistro per evitare la distensione strutturale.
Iniettare 250 millilitri di soluzione isotonica salina attraverso la cannula arteriosa per lavare il sangue rimanente dal letto vascolare. Per la configurazione della perfusione, posizionare attentamente i polmoni isolati nella camera polmonare. Collegare la trachea al trasduttore sul coperchio della camera e collegare i vasi cannulati al sistema di perfusione, quindi chiudere e fissare la camera con il blocco rotante.
Quindi, collegare il coperchio della camera e passare sopra il rubinetto per passare dalla ventilazione a pressione positiva a quella negativa. Perfondi i polmoni con 200 millilitri di perfusato artificiale senza sangue a partire dal flusso a tre millilitri al minuto per chilogrammo, quindi aumenta lentamente il flusso in cinque minuti a cinque millilitri al minuto per chilogrammo. E per i prossimi cinque minuti, lascia che il flusso raggiunga otto millilitri al minuto per chilogrammo, seguito da un flusso massimo di 10 millilitri al minuto per chilogrammo per cinque minuti.
Ventilare i polmoni con aria umidificata ad una frequenza di 30 battiti al minuto, un volume di marea di 10 millilitri per chilogrammo e una pressione espiratoria finale di due centimetri di colonna d'acqua. Per raggiungere le condizioni della zona tre, attendere da 10 a 15 minuti per ottenere un equilibrio caratterizzato da uno stato gravimetrico ISO, assicurando che la pressione venosa sia stabile in tutto il registro. Assicurarsi che il peso del polmone rimanga costante e che le pressioni arteriose e atriali sinistre siano stabili per ottenere condizioni di zona tre per aprire un numero massimo di vasi polmonari e mantenere il contenuto del letto microvascolare durante l'esperimento.
Per il controllo elettronico e l'elaborazione del segnale, assicurarsi che il flusso respiratorio, le variazioni di peso, la pressione microvascolare, il volume delle maree, la resistenza vascolare, tra gli altri, siano registrati su un'unità elettronica centrale multipla che integra i segnali provenienti dai trasduttori e li visualizza sul sistema di valutazione. È stata valutata la concentrazione di 5-HT e monoamino ossidasi coinvolte nel metabolismo polmonare e nella permeabilità vascolare. La concentrazione di 5-HT e monoamino ossidasi ha raggiunto il picco dopo 15 minuti di conservazione e poi è diminuita durante le sei ore successive.
Successivamente, i livelli di perfusione hanno mostrato un aumento non statisticamente significativo fino a 24 ore. I tassi di rilascio di 5-HT e monoamino ossidasi hanno indicato che durante la prima ora della conservazione, i livelli di 5-HT sono aumentati più in alto della monoamino ossidasi e sono diminuiti entro sei ore dopo essere stati ricatturati dalle cellule endoteliali e dalle piastrine, nonché dal catabolismo mediato dalla monoamino ossidasi. L'attività dell'endopeptidasi neutra è aumentata a nove ore e poi è diminuita ed è rimasta stabile per 12-24 ore.
L'attività dell'enzima di conversione dell'angiotensina è diminuita dopo quattro ore, quindi è aumentata ed è rimasta stabile nel tempo fino a 24 ore. L'effetto della conservazione polmonare nella permeabilità capillare è stato valutato per 24 ore, indicando che il polmone perfuso ha subito un progressivo aumento del coefficiente di filtrazione capillare. È stato controllato l'effetto di diversi additivi nella permeabilità capillare del sistema di perfusione polmonare isolato in diverse condizioni ed è stato osservato un aumento massimo della permeabilità con l'atropina.
La manovra più importante è posizionare correttamente i polmoni in una camera polmonare e collegare i vasi cannulati al sistema di perfusione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso le interazioni tra sostanze circolatorie e gli effetti di sostanze inalate o perfuse come nei test antidroga e in varie patologie polmonari.
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Panoramica
Il preparato polmonare isolato del coniglio è uno strumento fondamentale nella ricerca polmonare, che consente lo studio dei meccanismi fisiologici e patologici. Questa tecnica facilita la caratterizzazione della fisiologia e della patologia polmonare mediante la misurazione delle attività metaboliche e della funzione respiratoria.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca polmonare
- Fisiologia
- Patologia
Sfondo
- Il sistema di perfusione polmonare isolata consente lo studio di un organo funzionale completo.
- Questo metodo ricrea la ventilazione e la perfusione per l'analisi continua della funzione fisiologica.
- Fornisce informazioni sulle capacità non respiratorie dei tessuti polmonari.
- I componenti principali includono l'attività dei macrofagi alveolari e dei tessuti endoteliali.
Scopo dello studio
- Descrivere la tecnica di preparazione del polmone isolato del coniglio.
- Studiare la reattività delle vie aeree e la conservazione del polmone.
- Sostenere la ricerca preclinica nel trapianto polmonare e nell'edema polmonare.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio dell'apparato funzionante con i componenti essenziali.
- Collegamento dei trasduttori all'unità elettronica centrale.
- Preparazione del sistema di ventilazione.
- Esecuzione di procedure chirurgiche sul coniglio anestetizzato.
Risultati principali
- La tecnica consente misurazioni dettagliate della funzione respiratoria.
- Migliora la comprensione delle attività metaboliche nei tessuti polmonari.
- Facilita lo studio di vari componenti polmonari.
- Fornisce un modello affidabile per la ricerca preclinica.
Conclusioni
- La preparazione del polmone isolato del coniglio è uno strumento di ricerca prezioso.
- Contribuisce in modo significativo alla comprensione della fisiologia e della patologia polmonare.
- Questo metodo è essenziale per far progredire la ricerca sulle malattie correlate ai polmoni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il sistema di perfusione polmonare isolata consente una valutazione diretta delle risposte polmonari a composti farmacologici in un modello ex vivo fisiologicamente rilevante. Questo approccio supporta la validazione del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico misurando attività metaboliche, permeabilità vascolare e funzione respiratoria in un sistema d'organo completo. Fornisce un'elevata affidabilità predittiva per l'identificazione di composti promettenti nella scoperta di farmaci respiratori simulando la fisiologia polmonare umana senza la variabilità associata all'intero organismo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'interazione con bersagli polmonari mediante la valutazione dell'attività metabolica dei macrofagi alveolari e del tessuto endoteliale.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli polmonari attraverso la misurazione in tempo reale della meccanica respiratoria e delle risposte vascolari.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico quantificando il coefficiente di filtrazione capillare (Kfc) per valutare la formazione di edema e l'integrità della barriera.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce dati quantitativi risolti nel tempo sugli enzimi metabolici polmonari, come la cinetica di rilascio della 5-HT e della monoammina ossidasi.
- Valore operativo: Standardizza i parametri di perfusione e ventilazione (ad esempio, volume corrente 10 mL/kg, PEEP 2 cm H₂O) per test riproducibili dei composti.
- Prontezza del saggio: Consente la valutazione di sostanze inalate o perfuse sulla fisiologia polmonare in condizioni controllate di zona tre.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Modella la dinamica della perfusione polmonare umana per supportare la valutazione preclinica di candidati farmaci polmonari.
- Allineamento dei Biomarcatori: Monitora le variazioni dell'attività enzimatica (ad esempio, enzima convertitore dell'angiotensina, endopeptidasi neutrale) come biomarcatori traslazionali della conservazione polmonare.
- Decisioni Adeguate al Rischio: Permette una valutazione longitudinale della vitalità del polmone (finestra temporale di 5–8 h) per informare criteri di prosegui/non prosegui nello sviluppo di terapie polmonari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema di perfusione polmonare isolato si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio fino alla valutazione preclinica, consentendo un affinamento iterativo dei candidati farmaci polmonari sulla base di letture funzionali a livello d'organo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su bersagli polmonari mediante il monitoraggio in tempo reale di parametri metabolici e respiratori.
- Screening: Fornisce dati quantitativi standardizzati su perfusione e ventilazione, essenziali per la riproducibilità dei saggi e la classificazione dei composti.
- Analisi: Genera parametri misurabili quali il coefficiente di filtrazione capillare (Kfc), la resistenza vascolare, il volume corrente e i tassi di rilascio enzimatico, utili per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase iniziale della scoperta alla continuità preclinica modellando la conservazione del polmone e il decorso delle lesioni in modo rilevante per l'uomo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per test ripetuti di più composti o condizioni entro una finestra di vitalità definita.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella risposta polmonare al farmaco.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità attraverso protocolli standardizzati di cannullazione, perfusione e ventilazione.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo un rilevamento precoce delle criticità polmonari, riducendo l'abbandono nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei composti aggiustata per il rischio in base alla sicurezza polmonare e agli esiti funzionali.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche chirurgiche su roditori, cannulazione vascolare ed espianto del blocco cardiopolmonare.
- È dipendente da strumentazione di precisione, inclusi pneumotacografo, trasduttore di peso e unità elettronica centrale per l'integrazione del segnale.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda le portate di perfusione (3–10 mL/min/kg) e i parametri di ventilazione (30 atti/min, volume corrente di 10 mL/kg).
- Richiede considerazioni adattative per diverse specie o modelli di malattia, a causa delle risposte vascolari e metaboliche specifiche per ciascuna specie.
- È limitato dall'aumento progressivo del coefficiente di filtrazione capillare nel tempo, che limita la durata dell'esperimento a 5–8 ore prima dello sviluppo significativo di edema.
