Name: Estrazione del cofattore F420 per lanalisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Scopri il metodo ottimizzato per l'estrazione del cofattore F420 da colture metanogeniche e campioni ambientali complessi. Questa tecnica cromatografica consente l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato con elevata riproducibilità.

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Ringraziamo con gratitudine il Prof. Colin Jackson per il supporto con il cofattore purificato F420. Questa ricerca è stata sostenuta dal Fondo scientifico tirolese (TWF) e dall'Universität Innsbruck (Publikationsfonds). Riconosciamo vivamente il supporto di GPS, HK, SB, GG e HB.

NOTA: L'estrazione e l'analisi del cofattore F420 è un processo in tre fasi che include la lisi del campione, la pre-purificazione del cofattore tramite estrazione in fase solida (SPE) e il rilevamento del cofattore tramite RP-HPLC accoppiato a ioni (IP-RP-HPLC) con rilevamento a fluorescenza. Prima di iniziare, preparare i materiali e i reagenti come indicato nella Tabella 1.
1. Lisi del campione
<ol><li>Aggiungere fino a 5 g di campione in provette appropriate (ad esempio, tubi conici da 50 ml).</li>
	<li>Aggiungere 5 mL del tampone di lisi (2x soluzione madre, Tabella 1) ai campioni.</li>
	<li>Portare ad un volume finale di 10 ml con acqua distillata per raggiungere una concentrazione finale di 0,5 g·mL-1.</li>
	<li>Vortice i campioni diluiti per 20 s.</li>
	<li>Autoclave per 30 min a 121 °C.</li>
	<li>Per i campioni secchi come il terreno forestale, portare a un volume finale di 20 ml con acqua distillata dopo l'autoclave e vorticare il campione diluito. ATTENZIONE: l'aumento della temperatura durante l'autoclave potrebbe causare lo scoppio dei tubi.</li>
</ol>2. Pre-purificazione del cofattore F 420 tramite estrazione in fase solida (SPE)
NOTA: Tutte le fasi della SPE sono condotte a temperatura ambiente
<ol><li>Raffreddare i campioni a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare i campioni autoclavati per 5 min a 11.000 x g.</li>
	<li>Preparare colonne SPE da 5 ml riempite con 100 mg di assorbente polimerico in modalità mista ad anione debole.</li>
	<li>Condizionare lo scambiatore di anioni con 3 ml di metanolo (soluzione di condizione, Tabella 1).</li>
	<li>Equilibrare lo scambiatore di anioni con 3 ml di acqua distillata (soluzione di equilibratura, tabella 1).</li>
	<li>Caricare fino a 9,0 ml del surnatante dal lisato centrifugato sulla colonna SPE.</li>
	<li>Lavare via le impurità con 5 mL di acetato di ammonio da 25 mM (soluzione di lavaggio SPE 1, Tabella 1).</li>
	<li>Lavare via le impurità con 5 ml di metanolo (soluzione di lavaggio SPE 2, Tabella 1).</li>
	<li>Eluire il cofattore F420 in 1,0 mL di tampone di eluizione (Tabella 1). NOTA: Preparare un tampone di eluizione fresco. A causa del vuoto applicato e dell'elevata pressione di vapore del tampone di eluizione, i volumi di eluizione potrebbero differire da campione a campione. Al fine di garantire lo stesso volume finale in tutti i campioni, si raccomanda di pesare i recipienti di raccolta prima e dopo l'eluizione e calcolare il volume di eluizione effettivo. Bilanciare le differenze con l'aggiunta del tampone di eluizione.</li>
</ol>3. Rilevazione del cofattore F420
<ol><li>Impostare il forno a 40 °C e il rivelatore a fluorescenza a 420 nm di lunghezza d'onda di estinzione e 470 nm di lunghezza d'onda di emissione. Ottenere la separazione tramite modalità gradiente utilizzando le fasi mobili A e B (Tabella 1): 0-3 min: 26% B; 3-24 min: 26%-50% B; 24-25 min: 50% B; 25-27 min: 50%-26% B; 27-35 min: 26% B ad una portata di 0,75 mL·min-1. NOTA: Garantire l'equilibrio delle condizioni della colonna prima dell'iniezione dei campioni lavando la colonna almeno con volumi a 3 colonne di fase mobile A al 74% e al 26% fase B mobile (tabella 1).<ol>
<li>Filtrare i campioni eluiti dall'SPE in flaconcini HPLC utilizzando un filtro PTFE con una dimensione dei pori di 0,22 μm. NOTA: si consigliano filtri ptfe con una dimensione dei pori di 0,22 μm.</li>
		<li>Iniettare 50 μL del campione eluito sul sistema HPLC per analizzare la composizione e la concentrazione del cofattore F420 . NOTA: poiché in questo protocollo non viene utilizzato alcuno standard quantitativo, i campioni e le varianti devono essere confrontati per area di picco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
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<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
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<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
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<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per la valutazione del cofattore F420 da colture pure metanogeniche, è possibile eseguire una valutazione microscopica per visualizzare la crescita e l'attività (microscopia a fluorescenza) dei microrganismi coinvolti (Figura 1). Per i campioni derivanti da ambienti naturali, l'uso della microscopia per rilevare o quantificare F420 è limitato a causa di interferenze con altri microrganismi fluorescenti, particelle organiche e inorganiche. In questo contesto, l'estrazion...

F420 è un cofattore diffuso ma spesso trascurato, che funziona come un vettore obbligato di idruro a due elettroni nei processi metabolici primari e secondari sia di Archaea che di Bacteria1,2. F420 è una 5-deazaflavina e strutturalmente simile alle flavine, per cui le sue proprietà chimiche e biologiche sono più paragonabili a quelle di NAD+ o NADP+. A causa della sostituzione dell'azoto con il carbonio in posizione 5 dell'anello isoallossiazinico, è un forte riducente, esibendo così un basso potenziale redox standard di -340 mV1,3. F420 comprende un anello 5-deazaflavina e un linker 2-fosfo-L-lattato (F420-0). Una coda oligoglutammata contenente n+1 monomeri di glutammato può essere attaccata alla molecola (F420-n+1)4.
Per molto tempo, il cofattore F420 è stato associato esclusivamente ad Archaea e Actinobacteria. Questo è stato in gran parte ribaltato. Recenti analisi hanno rivelato che F420 è distribuito tra diversi organismi anaerobici e aerobici dei phyla Proteobacteria, Chloroflexi e potenzialmente Firmicutes che abitano una miriade di habitat come suoli, laghi e intestino umano1,5. Nel 2019, Braga et al.6, hanno dimostrato che il proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica produce un derivato F420 unico, contenente un 3-fosfoglicerato invece di una coda 2-fosfolactato, che potrebbe essere diffuso in vari habitat. All'interno del dominio Archaea, F420 è stato trovato in diversi lignaggi, tra cui metanogenico7, metanotrofico8,9 e ordini di riduzione del solfato10, e si suppone che sia prodotto in Thaumarchaeota11. F420 è meglio conosciuto come un coenzima redox essenziale nella metanogenesi idrogenotrofica e metilotrofica. La forma ridotta di F420 (F420H2) funziona come donatore di elettroni per la riduzione della metilenetetraidrometanopterina (metilene-H4MPT, Mer) e del metile-H4MPT12,13. Può anche essere usato come vettore di elettroni in vie di trasporto di elettroni indipendenti da H2 di metanogeni contenenti citocromi12,14. Inoltre, la forma ossidata di F420 ha una caratteristica fluorescenza blu-verde all'eccitazione a 420 nm, che facilita la rilevazione dei metanogeni al microscopio (Figura 1). Grazie al suo basso potenziale redox, F420 facilita (i) la riduzione esogena di un ampio spettro di composti organici altrimenti recalcitranti o tossici, (ii) la sintesi di antibiotici tetracicline e lincosamide o fitotossine negli streptomiceti (phylum Actinobacteria) e (iii) la resistenza allo stress ossidativo o nitrosativo o ad altre condizioni sfavorevoli nei micobatteri (phylum Actinobacteria)1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Di conseguenza, le ossidoreduttasi F420-dipendenti sono biocatalizzatori promettenti per scopi industriali e farmaceutici, nonché per il biorisanamento di ambienti contaminati1,23. Nonostante queste recenti scoperte, i ruoli esatti del cofattore F420 sono ancora marginalmente noti negli Actinobacteria o in altri phyla batterici.
Esistono almeno tre percorsi per la biosintesi F4202,6,24. All'inizio, la via della biosintesi è divisa in una biosintesi a 5-deazaflavina e un ramo del metabolismo a 2-fosfolattato. La parte reattiva della molecola F420 viene sintetizzata tramite FO-sintasi utilizzando i substrati tirosina e 5-ammino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pirimidinedione. Il risultato è il cromoforo FO a livello di riboflavina. All'interno del ramo del metabolismo del lattato attualmente accettato, L-lattato è fosforilato a 2-fosfo-L-lattato da una L-lattato chinasi (CofB); Il 2-fosfo-L-lattato, a sua volta, è guanilato a L-lattil-2-difosfo-5'-guanosina dalla 2-fosfo-L-lattato guanililtransferasi (CofC). Nella fase successiva, L-lattil-2-difosfo-5'-guanosina è collegata a FO da una 2-fosfo-L-lattato transferasi (CofD) per formare F420-02. Infine, l'enzima F420-0:ɣ-glutamil ligasi (CofE) lega i monomeri di glutammato a F420-0, formando il cofattore finale6 in numeri variabili23,25. Organismi diversi mostrano modelli diversi nel numero di residui di glutammato attaccati, con code più corte trovate per i metanogeni rispetto ai micobatteri2,25,26. Generalmente, i metanogeni mostrano lunghezze della coda da due a tre, con fino a cinque nel metanogeno acetoclastico, Methanosarcina sp., mentre le lunghezze della coda trovate in Mycobacterium sp. variavano da cinque a sette residui di glutammato2,25,26,27. Tuttavia, recenti scoperte hanno mostrato che F420 a catena lunga si lega alle ossidoreduttasi F420-dipendenti con un'affinità maggiore rispetto alla F420 a catena corta; inoltre, il legato A catena lunga F420 aumenta l'affinità del substrato ma diminuisce il tasso di turnover dei rispettivi enzimi23.
Il rilevamento del cofattore F420 è spesso basato sulla sua fluorescenza. In tal modo, i suoi derivati oligo glutammato sono stati separati utilizzando LA fase inversa (RP)-HPLC27,28. Recentemente, Ney et al. hanno utilizzato l'idrossido di tetrabutilammonio come reagente di accoppiamento ionico per la coda di glutammato caricata negativamente per migliorare con successo la separazione su RP-HLPC5. Qui, presentiamo un metodo per la preparazione di campioni, successiva lisi, estrazione, purificazione, separazione e quantificazione del cofattore F420 non solo da colture pure ma anche da diversi campioni ambientali (cioè terreni e fanghi del digestore).

<table><tbody><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema HPLC biocompatibile dotato di modulo di gradiente, forno e rivelatore di fluorescenza</td> Sistema <td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga e rotore per 50 mL" Falco" tubi (11.000 rcf) e tubi</td><td></td><td></td><td></td>appropriati</tr><tr><td>Colonna HPLC: Gemini NX C18, 5 &mu; m, 150 x 3 mm</td> Filtro in PTFE a colonna <td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>(dimensione dei pori 0,22 &; micro; m) per rimuovere il particolato prima dell'analisi</td><td></td><td></td><td></td>HPLC</tr><tr><td>Resina per SPE: Strata-X-AW 33 &mu; m come adsorbente polimerico a modalità mista anione debole</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>sorbente polimerico a modalità mista ad anione debole</td></tr><tr><td>Collettore a vuoto per SPE e provette</td><td></td><td></td> di raccolta appropriate <td>Attrezzatura SPE Miscelatore</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>a vortice</td></tr></tbody></table>

estrazione del cofattore f420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

Il cofattore F420 svolge un ruolo centrale come vettore di idruro nel metabolismo primario e secondario di molti taxa batterici e archeali. Il cofattore è meglio conosciuto per il suo ruolo nella metanogenesi, dove facilita reazioni termodinamicamente difficili. Poiché la coda di poliglutammato varia in lunghezza tra diversi organismi, le analisi del profilo di lunghezza potrebbero essere un potente strumento per distinguere e caratterizzare diversi gruppi e percorsi in vari habitat. Qui, il protocollo descrive l'estrazione e l'ottimizzazione del rilevamento del cofattore F420 applicando l'estrazione in fase solida combinata con l'analisi cromatografica liquida ad alte prestazioni indipendente dagli approcci biologici culturali o molecolari. Il metodo è stato applicato per ottenere ulteriori informazioni sull'espressione del cofattore F420 da comunità microbiche in terreni, fanghi anaerobici e colture pure ed è stato valutato mediante esperimenti di spiking. In tal modo, lo studio è riuscito a generare diversi profili di lunghezza della coda F420 per metanogeni idrogenotrofici e acetoclastici in colture pure metanogeniche controllate, nonché da campioni ambientali come fanghi e terreni del digestore anaerobico.

Le colture pure di Methanosarcina thermophila e Methanoculleus thermophilus, entrambe archee metanogeniche termofile, sono state coltivate in mezzi idonei come descritto in precedenza29,30. Per Methanosarcina thermophila, il metanolo è stato utilizzato come fonte di energia, mentre Methanoculleus thermophilus è stato coltivato su H2 / CO2. La crescita è stata controllata mediante valutazione micro...

Un metodo per l'estrazione del cofattore F420 da colture pure è stato ottimizzato per la separazione cromatografica liquida e l'analisi della lunghezza della coda F420 in campioni di coltura pura e ambientali.

Estrazione del cofattore F420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

Il cofattore F420 svolge un ruolo importante nel metabolismo primario e secondario di molti procarioti. La misurazione di questa molecola in campioni ambientali consente una comprensione più profonda della sua prevalenza e funzione. Questa tecnica consente l'analisi del cofattore in materiali campione difficili come fanghi e terreno.In tal modo la lisi del materiale e la pre-purificazione prima dell'analisi sono i passaggi centrali. Il protocollo include diversi passaggi durante la preparazione del campione. Questi passaggi devono essere pianificati e preparati molto bene prima di iniziare con l'elaborazione del campione.Ad esempio, la preparazione di tamponi freschi è importante. Per iniziare la lisi del campione, posizionare cinque grammi del campione in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi aggiungere cinque millilitri di tampone di lisi 2X ai campioni e portare il volume a 10 millilitri con acqua distillata per raggiungere una concentrazione finale di 0,5 grammi per millilitro.Vortice dei campioni diluiti per 20 secondi seguiti da autoclave per 30 minuti a 121 gradi Celsius. Per i campioni secchi come il suolo forestale, portare a un volume finale di 20 millilitri con acqua distillata dopo l'autoclave e ruotare nuovamente il campione diluito per 20 secondi, come dimostrato. Una volta che i campioni si raffreddano, centrifugare il lisato del campione per cinque minuti a 11.000 x g e raccogliere il surnatante.Preparare un'estrazione in fase solida di cinque millilitri o una colonna SPE riempita con 100 milligrammi di assorbente polimerico in modalità mista ad anione debole condizionando lo scambiatore di anioni con tre millilitri di metanolo. Quindi, equilibrare lo scambiatore di anioni con tre millilitri di acqua distillata. Caricare fino a nove millilitri del surnatante dal lisato centrifugato sulla colonna SPE.Lavare sequenzialmente le impurità dalla colonna con cinque millilitri di acetato di ammoniaca da 25 millimolari e cinque millilitri di metanolo. Dopo il lavaggio, eluire il cofattore F420 con un millilitro di tampone di eluizione. Preimpostare il forno a 40 gradi Celsius e impostare il rilevatore di fluorescenza su 420 nanometri di lunghezza d'onda di estinzione e 470 nanometri di lunghezza d'onda di emissione.Quindi, filtrare il campione eluito dall'SPE in flaconcini HPLC utilizzando un filtro PTFE con una dimensione dei pori di 0,22 micron. Iniettare 50 microlitri del campione filtrato nel sistema HPLC e separare il cofattore F420 tramite la modalità gradiente utilizzando una combinazione di fasi mobili come descritto nel manoscritto. Analizzare la composizione e la concentrazione del cofattore F420.La crescita di colture pure di metanogeni è stata verificata al microscopio. Nella microscopia a contrasto di fase, sono visibili agglomerati di metanogeni, che emettono una luce bluastra quando il cofattore F420 è eccitato con luce ultravioletta. È stata analizzata l'area di picco del cofattore recuperato F420 dopo SPE con diversi volumi delle colture di Methanoculleus thermophilus.La strategia di disintegrazione in autoclave ha raggiunto l'area di picco più elevata, concludendo la massima efficienza di estrazione utilizzando un trattamento pressione-temperatura. L'analisi della distribuzione della lunghezza della coda ha rivelato le differenze nella concentrazione complessiva del cofattore F420 e nella distribuzione della lunghezza della coda F420 delle colture metanogeniche pure nei campioni ambientali. Quando si applica questa procedura, tenere presente di raccogliere completamente il volume totale del tampone di eluizione o registrare il volume esatto del flusso attraverso.Questa tecnica apre la strada all'esplorazione del cofattore F420 in campioni più complessi come terreni e fanghi e consente di approfondire l'impatto ecologico di questa molecola.

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Estrazione del cofattore F420 per lanalisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali (Video) | JoVE Journal

Estrazione del cofattore _F420 per l'analisi della lunghezza della coda di poliglutammato da colture pure metanogeniche e campioni ambientali

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