Un modello preclinico di colpo di calore da sforzo nei topi

Il protocollo descrive lo sviluppo di un modello standardizzato, ripetibile, preclinico di colpo di calore da sforzo (EHS) in topi privi di stimoli esterni avversi come scosse elettriche. Il modello fornisce una piattaforma per studi meccanicistici, preventivi e terapeutici.

In precedenza, solo i modelli passivi di colpo di calore sono stati ben consolidati. Questo modello di colpo di calore da sforzo è privo di grandi limitazioni e imita più da vicino la fisiopatologia umana. Non è possibile studiare efficacemente il colpo di calore negli esseri umani perché è una condizione pericolosa per la vita.

Questo modello preclinico mantiene le caratteristiche cliniche del colpo di calore da sforzo umano. Questa tecnica aiuta a testare gli effetti della velocità di raffreddamento sul recupero dal colpo di calore da sforzo, le comorbidità dall'ingestione di farmaci e le conseguenze a lungo termine dell'esposizione al colpo di calore. A dimostrare la procedura sarà Jamal Alzahrani, uno studente di dottorato senior del laboratorio del Dr.Clanton.

Dopo aver anestetizzato il topo, utilizzare lubrificante per gli occhi come l'unguento veterinario per proteggere gli occhi dell'animale da danni o lesioni durante l'intervento chirurgico. Per preparare il sito chirurgico, radersi l'addome inferiore con piccoli tagliacapelli per animali o un dispositivo di rimozione dei capelli disponibile in commercio. Somministrare la prima dose di buprenorfina sottocutanea 0,1 milligrammi per chilogrammo.

Strofinare l'area con tre lavaggi di povidone-iodio o clorexidina, seguiti da risciacquo con alcool isopropilico al 70%, quindi trasferire il mouse nell'area chirurgica, utilizzare un drappo adesivo per isolare il sito chirurgico sul topo. Utilizzando strumenti sterili in tecnica asettica, fare un'incisione di circa un centimetro sulla linea mediana lungo la linea alba a circa 0,5 centimetri dal margine costale, quindi separare la pelle dallo strato muscolare e fare un'incisione leggermente più piccola sulla linea alba facendo attenzione a non danneggiare l'intestino o gli organi interni. Una volta aperto lo strato muscolare, posizionare il telemetro sterile nella cavità intraperitoneale di fronte alle arterie caudali e alle vene e dorsale agli organi digestivi per consentirgli di fluttuare liberamente.

Chiudere l'apertura addominale con una sutura assorbibile sterile 5-O e chiudere la pelle utilizzando un semplice punto interrotto con sutura prolina 5-O. Metti il mouse nella sua gabbia pulita con una piastra riscaldante a microonde sotto la gabbia. Monitorare il mouse ogni 15 minuti durante la prima ora di recupero dall'anestesia e quindi tornare alla struttura di stabulazione degli animali.

La notte prima del protocollo di colpo di calore da sforzo, posizionare il mouse nella camera ambientale a temperatura ambiente per acclimatarsi alla camera. Utilizzare il sistema di acquisizione dati per raccogliere la temperatura interna continua o TC mediata su intervalli di 30 secondi durante la notte. La mattina del protocollo di colpo di calore da sforzo, assicurarsi che il mouse sia pari o inferiore al normale intervallo di temperatura diurna da 36 a 37,5 gradi Celsius prima di aumentare la temperatura della camera per assicurarsi che il mouse non abbia la febbre o abbia sperimentato uno stress eccessivo durante questo periodo.

Una volta che il mouse è stabile e all'interno di un intervallo di normale temperatura interna a riposo, rimuovere il cibo e l'acqua e pesare l'animale. Chiudere la porta della camera e aumentare la temperatura della camera a un obiettivo di 37,5 gradi Celsius e dal 40 al 50% di umidità relativa o la temperatura e l'umidità ambientali desiderate. Verificare la temperatura e l'umidità della camera con un monitor di temperatura e umidità calibrato.

Circonda la camera con una tenda oscurante per mantenere la luce e i disturbi minimi durante il protocollo. Monitorare continuamente il mouse durante il protocollo tramite telecamere ir illuminate da remoto. Focalizzare la seconda telecamera sul monitor di temperatura e umidità posizionato vicino alla ruota di marcia.

Effettuare regolazioni al controller per il set point della camera ambientale per garantire letture accurate della temperatura vicino all'animale. Una volta che la camera ha raggiunto la temperatura target misurata dalla seconda telecamera sul monitor della temperatura, aprire rapidamente lo sportello della camera e posizionare il mouse nella rotella di corsa forzata. Avviare il protocollo della ruota di corsa forzata a una velocità di 2,5 metri al minuto e aumentare la velocità di 0,3 metri al minuto ogni 10 minuti fino a quando il mouse raggiunge una temperatura interna di 41 gradi Celsius.

Una volta raggiunta la temperatura interna, lasciare che la velocità rimanga costante fino a quando non si verifica una limitazione dei sintomi, caratterizzata da un'apparente perdita di coscienza, una caduta all'indietro o uno svenimento e l'incapacità di continuare a correre o aggrapparsi alla ruota. Confermare il punto temporale in cui il mouse ha tre rotazioni all'indietro sulla rotellina senza segni di risposta fisica. In alternativa, identificare l'endpoint umano seguendo le regole IACUC locali per determinare quando interrompere il protocollo.

Questo endpoint è leggermente superiore alla limitazione dei sintomi essenzialmente in tutti i topi. Per eseguire il protocollo di raffreddamento rapido, arrestare la rotellina una volta che il mouse raggiunge la limitazione dei sintomi e rimuovere immediatamente il mouse dalla rotellina di corsa forzata. Pesare il mouse e rimetterlo nella sua gabbia di casa per recuperare a temperatura ambiente.

Durante questo periodo, lasciare la porta della camera aperta e riportare il set point dell'incubatore a temperatura ambiente per consentire alla camera di raffreddarsi rapidamente, il che si traduce in una sopravvivenza a lungo termine superiore al 99%. Per eseguire un'esposizione al colpo di calore da sforzo più grave, mantenere la gabbia dell'animale all'interno della camera a 37,5 gradi Celsius durante il protocollo di colpo di calore da sforzo. Quando l'animale raggiunge la limitazione dei sintomi, permetti loro di rimanere nella ruota di corsa fino a quando non ritornano alla coscienza come osservato dalla telecamera remota, quindi rimuovi rapidamente il mouse dalla ruota di corsa e riportalo direttamente alla sua gabbia preriscaldata per ottenere un profilo di raffreddamento molto più lento, eliminando essenzialmente la fase ipotermica del colpo di calore da sforzo.

Rimuovere la parte superiore del filtro dalla gabbia durante questo periodo per migliorare l'equilibrio con la camera. Una gabbia di recupero pre-raffreddata a temperatura ambiente può essere utilizzata per eseguire una procedura alternativa meno grave per provocare una fase ipotermica soppressa con un tasso di sopravvivenza del 100% Per il protocollo di colpo di calore da sforzo grave, monitorare attentamente i topi durante il recupero e controllare continuamente gli endpoint umani, compresi i normali movimenti durante il recupero, come la toelettatura, respirazione normale e leccare. Monitorare la temperatura interna durante questo periodo.

È improbabile che i topi si riprendano se la loro temperatura interna inverte la direzione durante la fase di recupero, superando infine i 40 gradi Celsius. In tal caso, terminare l'esperimento e continuare a valutare il mouse per gli endpoint umani standard. I tipici profili termoregolatori durante l'intero protocollo di colpo di calore da sforzo nel recupero precoce di un topo comprendono quattro fasi distinte che possono essere definite come la fase di riscaldamento della camera, la fase di esercizio incrementale, la fase di esercizio dello stato stazionario e una fase di recupero con un metodo di raffreddamento rapido o lento.

Per il modello severo, il profilo della temperatura di recupero ha indicato che la temperatura interna è rimasta superiore a 37 gradi Celsius per tutto il periodo di recupero di due ore. I topi femmina erano più resistenti al colpo di calore in questo modello e correvano distanze quasi due volte più lunghe rispetto ai topi maschi. Nessuna differenza è stata osservata nel tempo necessario per recuperare a 39,5 gradi Celsius nei due modelli.

Tuttavia, il tempo di raffreddamento alla temperatura ambientale di 37,5 gradi Celsius è stato notevolmente prolungato. La cosa più importante è l'attento monitoraggio degli animali in ogni momento post-chirurgico e colpo di calore post-sforzo. Questo metodo ha aiutato a studiare gli effetti a lungo termine dell'esposizione al colpo di calore fino a diversi mesi e ci ha anche permesso di misurare gli effetti di ulteriori fattori nella malattia da colpo di calore, come l'ingestione di farmaci antinfiammatori non steroidei ed epigenetica.