Definizione delle funzioni geniche nella tumorigenesi mediante ablazione ex vivo di alleli floxed in cellule tumorali maligne della guaina del nervo periferico

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire knockout genici che sono embrionali letali in vivo in tumori derivati da modelli murini geneticamente modificati e quindi valutare l'effetto che il knockout ha sulla crescita, proliferazione, sopravvivenza, migrazione, invasione e trascrittoma in vitro e in vivo.

Questo protocollo fornisce un metodo alternativo in vivo per studiare il ruolo di crescita tumorale di un knockout genico letale embrionale. Il vantaggio di questo metodo è che i knockout genici che sono normalmente letali embrionali possono essere eseguiti in tumori derivati da un modello murino geneticamente modificato per studiare i loro effetti di perdita di funzione in vivo. Questa tecnica può essere applicata a malattie che richiedono lo studio del ruolo in vivo di geni essenziali embrionali irraggiungibili dai tradizionali modelli murini knockout genici.

La generazione del modello animale richiede tempo e sono necessari test empirici per determinare il MOI ottimale per l'infezione adenovirale per garantire che venga raggiunta una ricombinazione appropriata. Per cominciare, identifica il mouse con il genotipo desiderato. Quando un topo portatore di tumore raggiunge il suo punto finale umano, eutanasizzare il topo e utilizzare un coltello da bisturi sterile per rimuovere il tumore.

Sezionare il tumore in tre sezioni in tagli in stile pagnotta di pane usando un coltello a bisturi per generare i segmenti di tessuto per la paraffina di fissazione della formalina incorporando la generazione di colture a passaggio precoce e il congelamento flash per le analisi analitiche. Macchiare una sezione di tessuto fissata in formalina di cinque micrometri e incorporata in paraffina con ematossilina ed eosina. Una volta che un patologo conferma il tumore, eseguire la colorazione immunoistochimica per confermare la diagnosi del tumore.

Posizionare il tessuto tumorale della guaina del nervo periferico maligno appena raccolto in 10 millilitri di PBS sterile ghiacciato su ghiaccio, quindi trasferirlo in un'area di lavoro sterile per stabilire colture di passaggio precoce. Tritare il tessuto tumorale in pezzi da due a quattro millimetri e triturare da otto a 10 volte in un piatto di coltura tissutale trattato con 10 centimetri quadrati contenente 10 millilitri di terreno di coltura. Coltivare questi tessuti in mezzo di crescita DMEM-10 ad alto contenuto di glucosio integrato con 10 neuregulin-1 beta nanomolari e due forskolin micromolari.

Seminare le cellule tumorali a passaggio precoce ad una densità di 1,5 volte 10 alla sesta cellula per un piatto di coltura tissutale trattato di 10 centimetri quadrati contenente terreno di coltura DMEM-10. Dopo 12-16 ore, lavare le colture aderenti con due o quattro millilitri di DPBS e infettare le cellule con adenovirus a circa 400 unità di formazione della placca per cellula in 10 millilitri di DMEM privo di siero. Dopo 48 ore dall'infezione, controllare brevemente le cellule per il segnale EGFP su un microscopio a fluorescenza per garantire un'infezione efficiente con circa il 50-100% di cellule positive, quindi FACS ordina le cellule infette EGFP-positive.

Dopo lo smistamento FACS, lasciare che le cellule recuperino in un incubatore di colture tissutali per almeno 24-48 ore, quindi preparare le cellule per analisi cellulari in vitro o innesti in vivo. Confermare la delezione di Erbb4 eseguendo la PCR utilizzando DNA genomico isolato da una porzione delle cellule EGFP-positive ordinate. Eseguire i test di proliferazione nei prossimi sette giorni su cellule tumorali selezionate placcate in una piastra a 96 pozzetti utilizzando un citometro automatizzato basato su immagini.

Colora le cellule con ganci e coloranti allo ioduro di propidio e cattura le immagini delle cellule usando un lettore automatico di lastre per contare il numero di cellule vive e morte in ciascun pozzetto. Isolare l'RNA totale da cellule tumorali selezionate utilizzando il fenolo guanidinio acido standard e il metodo a base di cloroformio. Aprire il software per eseguire l'allineamento della sequenza di RNA seguendo i passaggi specifici del programma utilizzando le impostazioni predefinite.

Selezionare il metodo di analisi, la ricerca dell'RNA, quindi selezionare il genoma di riferimento del topo. Caricare il file BED se fornito dal nucleo di sequenziazione. Caricare i file di sequenziazione FASTQ e assegnare nomi di replica univoci ai file.

Raggruppare i file FASTQ e designare i file in un set di replica. Per l'analisi statistica e di normalizzazione per identificare i segnali di espressione genica differenziale con una robusta potenza statistica, aprire il software di analisi e selezionare i file GFP FASTQ come set di dati di controllo. Quindi, selezionare DESeq2 come metodo statistico e di normalizzazione e avviare l'assemblaggio e l'analisi.

Utilizzare i set di dati di ontologia genica integrati negli strumenti di analisi dell'arricchimento funzionale ad accesso aperto per eseguire l'analisi di arricchimento funzionale sul DEG mediato da Erbb4 statisticamente significativo identificato per determinare il significato biologico e del percorso della perdita del gene Erbb4. Iniettare le cellule tumorali nel nervo sciatico del topo anestetizzato per valutare il potenziale di crescita dell'allotrapianto in vivo nelle cellule post-infette. Una volta che il tumore raggiunge le dimensioni richieste, sezionare il tumore da un topo eutanasizzato in due-tre sezioni, come dimostrato in precedenza.

Fissare una sezione di tessuto in 4% Paraformaldeide durante la notte, quindi incorporare la sezione fissa nella paraffina. Dopo aver realizzato sezioni spesse cinque micrometri dal tessuto FFPE, montare la sezione sui vetrini e confermare la presenza di cellule tumorali nel tessuto innestato utilizzando H & E e immunocolorazione come dimostrato in precedenza. Per confermare in vivo le differenze di espressione di Erbb4 tra le due condizioni sperimentali, colorare il tessuto fissato con formalina e incorporato nella paraffina con anticorpi specifici di Erbb4.

È stata analizzata la trasduzione delle cellule tumorali maligne della guaina del nervo periferico con adenovirus. Le cellule che esprimono EGFP sono state rilevate utilizzando la microscopia a fluorescenza e il numero totale di cellule è stato determinato utilizzando la microscopia a contrasto di fase. Dopo l'ablazione genica mediata da Cre, a seconda dell'efficienza della trasfezione, la genotipizzazione PCR ha mostrato un knockout genico completo e una popolazione eterogenea di cellule indotte e non indotte rispetto alla trasduzione di controllo.

L'istopatologia caratteristica riscontrata negli alloinnesti ortotopici dei tessuti tumorali maligni della guaina nervosa periferica rispetto ai tumori derivati dai modelli animali originali geneticamente modificati ha dimostrato una differenza nella morfologia cellulare. L'ablazione di Erbb4 ha ridotto la densità cellulare e la proliferazione cellulare nelle cellule adeno5-CMV-Cre-ablate controlla le cellule adeno5-CMV-GFP-trasdotte. L'espressione di Erbb4 nelle cellule tumorali trasdotte con adeno5-CMV-Cre, o virus EGFP, è diminuita nel risultato in alloinnesti trasdotti adeno5-CMV-Cre rispetto ai tumori alloinnesto trattati con adeno5-CMV-EGFP di controllo.

La densità vascolare è stata valutata tramite il rilevamento dell'immunoreattività per CD31 e i risultati rappresentativi hanno mostrato una densità vascolare marcatamente ridotta negli alloinnesti di cellule adeno5-CMV-Cre-trasdotte rispetto alle cellule trasdotte da adeno5-CMV-EGFP di controllo. Dopo l'ablazione genica, le cellule possono essere utilizzate per molti diversi tipi di saggi basati su cellule come proliferazione, migrazione, crescita 3D o alterazioni del microambiente, nonché per iniezioni ortotopiche in vivo.