Name: In vivo Valutazione della dinamica e dellorientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Impara a valutare la dinamica e l'orientamento dei microtubuli nei neuroni di Caenorhabditis elegans mediante imaging fluorescente in vivo. Questo metodo consente di analizzare il comportamento citoscheletrico durante lo sviluppo neuronale e la rigenerazione assonica.

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Ringraziamo Yishi Jin e Andrew Chisholm per il supporto iniziale e il ceppo utilizzato nello studio. Il ceppo batterico OP50 è stato utilizzato commercialmente dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC) finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Ringraziamo anche Dharmendra Puri per la standardizzazione delle procedure sperimentali. Lo studio è finanziato dalla sovvenzione principale del National Brain Research Centre (supportato dal Dipartimento di Biotecnologie, Govt. of India), DBT / Wellcome Trust India Alliance Early Career Grant (Grant # IA / E / 18/1 / 504331) a S.D., Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA / I / 13/1 / 500874) ad A.G.-R e una sovvenzione dal Science and Engineering Research Board (SERB: CRG/2019/002194) ad A.G.-R.

1. Ceppo reporter: cultura e manutenzione
NOTA: Per misurare la dinamica e l'orientamento dei microtubuli nei neuroni PLM, abbiamo usato il ceppo worm che esprime EBP-2::GFP sotto il promotore specifico del neurone tattile mec-4 ( allelejuIs338) 18,25,26. Per questo ceppo utilizziamo metodi standard di coltura e manutenzione dei vermi27.
<ol><li>Preparare il mezzo di crescita del nematode (3,0 g/L di cloruro di sodio, 2,5 g/L di peptone, 20,0 g/L di agar, 10 mg/L di colesterolo (diluito da una soluzione stock di 10 mg/ml)) in acqua e in autoclave la miscela.</li>
	<li>Raffreddare brevemente la miscela per 10-15 minuti prima di integrarla con 1 mM di cloruro di calcio, 1 mM di solfato di magnesio e 25,0 mM di fosfato di potassio monobasico pH 6,0.</li>
	<li>Versare circa 9 ml del composto in piastre di Petri da 60 mm utilizzando un dispenser sterile seguito da conservazione a temperatura ambiente e condizioni sterili per un giorno e successiva conservazione a 4 °C.</li>
	<li>Preparare 50 ml di brodo B (5,0 g/L di cloruro di sodio, 10,0 g/L di bacto-triptone), in autoclave e raffreddarlo prima di inoculare con una singola colonia di Escherichia coli (ceppo OP50).</li>
	<li>Colturare i batteri a 37 °C per 12 ore. Portare le piastre NGM refrigerate a temperatura ambiente per la semina e utilizzando uno spandi vetro sterilizzato fare uno striscio di batteri OP50 sulla piastra NGM.</li>
	<li>Mantenere le piastre NGM inoculate a 37 °C per 12 ore, il che consentirà la formazione di un prato batterico per la coltivazione di C. elegans. Queste piastre possono essere conservate in un incubatore a 20 °C fino all'uso.</li>
	<li>Allevare il ceppo transgenico sulle piastre NGM seminate.</li>
	<li>Sterilizzare un filo di platino sulla fiamma e raccogliere 20-25 ermafroditi adulti gravidi per il trasferimento in un piatto appena seminato.</li>
	<li>Una volta trasferito, spostare la piastra su un incubatore a 20 °C per 1 ora. Quindi, estrarre gli adulti da questi piatti. Queste piastre ora conterranno uova che sono abbinate all'età.</li>
	<li>Spostare le piastre nell'incubatrice a 20 °C per l'allevamento fino a raggiungere lo stadio di sviluppo di interesse che in questo caso è lo stadio L4 a 43,5 ore dopo la deposizione delle uova. Per più vermi, retroguardare più piastre per evitare l'affollamento.</li>
	<li>Nella fase di sviluppo desiderata, questi vermi possono essere montati per l'imaging delle comete EBP-2::GFP.</li>
</ol>2. Preparazione del campione: montaggio di vermi per l'imaging di comete EBP-2
NOTA: Per consentire l'osservazione dal vivo delle comete EBP nei neuroni PLM, abbiamo montato i vermi su cuscinetti di agarose per ridurre al minimo la loro mobilità senza compromettere la fisiologia del neurone. Tra i vari metodi di immobilizzazione, abbiamo scelto la soluzione di perline di polistirene da 0,1 μm prontamente disponibile in commercio. Abbiamo delineato la procedura di montaggio utilizzata specificamente per l'osservazione EBP-2::GFP.
<ol><li>Preparare una soluzione di acarosio al 10% fondendo 0,2 g di acarosio in 2 mL di 1 tampone M9 (0,02 M KH2PO4, 0,02 M Na2HPO4, 0,008 M NaCl, 0,02 M NH4Cl) in una provetta di vetro da 5 mL su una fiamma. Questa provetta può facilmente inserirsi in un blocco riscaldante che mantiene l'agarose allo stato fuso fino all'uso.</li>
	<li>Utilizzando un contagocce a bocca larga, erogare una goccia (circa 100 μL) di questo agarosio fuso su un vetrino pulito di dimensioni 35 mm x 25 mm.</li>
	<li>Mentre è allo stato fuso, premere la goccia con un'altra diapositiva di vetro per creare un film sottile dell'agarose tra le diapositive di vetro. L'agarose si solidifica come un film di circa 0,5 - 1,0 mm di spessore in circa 30 secondi.</li>
	<li>Una volta che l'agarose si solidifica, tenere la diapositiva inferiore nella mano non dominante e la diapositiva superiore nella mano dominante. Capovolgere la diapositiva superiore tenendo ferma la diapositiva inferiore a seguito della quale il cuscinetto di agarose si attacca a una delle due diapositive.</li>
	<li>Se il tampone di agarose formato è più grande della dimensione del coverslip (18 mm x 18 mm), tagliare i bordi del pad per ottenere le dimensioni richieste per garantire il corretto posizionamento del coverslip. Questi tamponi di agarose sono per l'uso immediato e non devono essere conservati.</li>
	<li>Ispezionare visivamente il tampone di agarosio per una superficie liscia che sia umida e adatta al montaggio. Se il tampone di agarose è esposto all'aria e si asciuga, la superficie del tampone di agarose appare rugosa. In tale scenario, preparare un tampone di agarose fresco come menzionato nei passaggi 2-6 di questa sezione.</li>
	<li>Sul tampone di agarose, mettere 2 μL di soluzione di polistirene da 0,1 μm come mezzo di montaggio.</li>
	<li>Scegli 3-4 vermi usando un plettro di filo di platino e spostali su una piastra NGM non semi. Questo processo garantisce la rimozione dei batteri superficiali che ostacolano l'immobilizzazione durante il montaggio.</li>
	<li>Una volta che i vermi strisciano fuori dai loro batteri superficiali, raccoglierli per il montaggio usando un plettro di filo di platino e risospese nella goccia di perline di polistirolo sul tampone di agarose.</li>
	<li>Con attenzione, posizionare un coperchio di 18 mm x 18 mm sui vermi. Per prevenire l'eviscerazione dei vermi montati, non spostare il coperchio dopo il posizionamento.</li>
	<li>Montare il vetrino preparato sul microscopio per l'imaging.</li>
</ol>3. Configurazione e acquisizione dell'imaging
NOTA: Le comete EBP viaggiano con una velocità approssimativa di 0,22 μm/s come osservato nei neuroni mammiferi e PLM di C. elegans16,18. Per campionare in modo ottimale gli eventi in un'acquisizione time lapse secondo i criteri di Nyquist28, sono necessarie scale spaziali e temporali di 0,09 μm e 0,43 s, rispettivamente. Per la prevenzione della fototossicità o del fotosableaching, abbiamo utilizzato l'acquisizione Spinning Disk. Di seguito sono descritte le impostazioni di configurazione e acquisizione delle immagini.
<ol><li>Cattura le immagini utilizzando un microscopio invertito dotato di un'unità disco rotante e di una fotocamera. Attivare la configurazione secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Attivare il software che controlla la configurazione.</li>
	<li>Poiché si tratta di un microscopio invertito, posizionare il vetrino con i vermi montati sul palco con un obiettivo a basso ingrandimento (5x o 10x) con il coperchio rivolto verso il basso.</li>
	<li>Impostare il percorso della luce verso la modalità occhio o visibile che utilizza l'illuminazione della lampada alogena per la luce trasmessa e della lampada ad arco di mercurio per la luce riflessa.</li>
	<li>Mettere a fuoco e centrare un worm nel campo visivo sotto il campo luminoso.</li>
	<li>Metti l'olio di immersione e cambia l'ingrandimento a 63x (1.4NA /Olio) e rifocalizza la coda del verme nel campo luminoso per i neuroni PLM.</li>
	<li>Accendere la fluorescenza della lampada ad arco di mercurio per una breve rifocalizzazione dei neuroni PLM. Posizionare il set corretto di riflettore (AF488) nel percorso della luce per la visualizzazione di GFP.</li>
	<li>Impostare il microscopio sull'acquisizione della fotocamera dirigendo il percorso della luce verso la fotocamera. NOTA: il controllo dei passaggi 4-7 di cui sopra attraverso lo schermo TFT (Thin Film Transistor) del microscopio è rapido e impedisce un'esposizione non necessaria all'illuminazione. In alternativa, controllare l'illuminazione, riflettore attraverso il software.</li>
	<li>Dopo la messa a fuoco del neurone PLM nel campo visivo, nell'interfaccia software selezionare l'illuminazione del laser a 488 nm con potenza del 30% e 300 ms di esposizione per la fotocamera con valore di guadagno ELECTRON Multiplying (EM) 70. A seconda dell'espressione del reporter, variare questi parametri in base alle esigenze. Memorizzare le impostazioni come configurazione per le sessioni di imaging successive.</li>
	<li>La scheda Canali memorizza le tracce ciascuna con un'illuminazione e un'impostazione della telecamera specifiche. La traccia evidenziata consente una visualizzazione dal vivo, mentre per acquisire un'immagine la traccia deve essere spuntata. Evidenziare un canale con brightfield (DIC) per la visualizzazione in tempo reale della coda del worm nell'area di lavoro. L'esempio è focalizzato e centrato nella finestra di creazione di immagini dal vivo dell'area di lavoro.</li>
	<li>Evidenzia il canale con eccitazione laser a 488 nm per una rapida messa a fuoco del neurone PLM nella finestra di imaging dal vivo. Una volta focalizzato, inizia l'acquisizione time lapse impostando i parametri della serie temporale come indicato nel passaggio successivo.</li>
	<li>Utilizzando l'illuminazione laser a 488 nm, impostare un esperimento con serie temporali per 2 minuti e nessun intervallo di tempo tra i fotogrammi. Per mantenere le scale temporali di acquisizione delle immagini, abbiamo acquisito solo la fluorescenza GFP.</li>
	<li>Utilizzando la scheda Avvia esperimento, iniziare l'acquisizione. L'utilizzo di un ingrandimento 63x limita la risoluzione spaziale a 0,21 μm che viene campionata dalla fotocamera alla dimensione dei pixel di 0,09 μm. Acquisire un intervallo di tempo a 3,3 fotogrammi/s per campionare in modo ottimale l'evento. L'immagine time lapse aveva 396 intervalli di tempo acquisiti per una durata di 2 minuti. Dopo l'acquisizione, salvare l'immagine nel formato predefinito, a cui è possibile accedere successivamente dal software predefinito o ImageJ.</li>
</ol>4. Osservazione e analisi
<ol><li>Visualizza in anteprima l'acquisizione del timelapse nel software predefinito o aprilo nell'immagine J tramite il suo plug-in Bioformats. NOTA: abbiamo descritto il processo di analisi delle immagini nell'immagine J.</li>
	<li>Installare il plug-in Bioformats in ImageJ.<ol>
<li>In alternativa, esportare il file di formato predefinito in .tif per la compatibilità dei file in ImageJ. La funzione di esportazione in ZEN2 genera singoli fotogrammi dell'immagine come file .tif discreti. Evitiamo questo metodo per prevenire la formazione di un gran numero di file.</li>
	</ol></li>
	<li>Apri l'immagine in formato '.czi' direttamente nell'immagine J attraverso il suo plugin 'Bioformats'. L'immagine si apre come una pila di più immagini. Se si utilizza la funzione "esporta" del software predefinito, ricostituire le immagini come stack multi-immagine utilizzando il seguente flusso di lavoro in ImageJ: ImageJ Program > Image Menu > Stacks Submenu > Images To Stack.</li>
	<li>Visualizza l'anteprima dell'immagine come filmato utilizzando l'icona Riproduci nell'angolo in basso a sinistra della finestra dell'immagine. Le comete possono essere viste come punti di puntura mobili luminosi nel corpo cellulare e nei processi del neurone PLM. Se le comete sono visibili chiaramente, procedere al passaggio 8 altrimenti seguire i passaggi 5-7 di questa sezione.</li>
	<li>Convertire il profilo colore dell'immagine utilizzando la tabella di ricerca (LUT) in un'immagine in scala di grigi: il programma ImageJ > menu Immagine > sottomenu Tabelle di ricerca > Seleziona grigi.</li>
	<li>Inverti il profilo LUT dell'immagine per una facile visualizzazione: il programma ImageJ > menu Immagine > sottomenu Tabelle di ricerca > Inverti LUT.</li>
	<li>Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine per vedere le comete: il programma ImageJ > menu Immagine > sottomenu Regola > Luminosità/Contrasto.<ol>
<li>Spostare i cursori minimo, massimo, luminosità e contrasto per il ridimensionamento desiderato delle intensità nell'immagine. Abbiamo quantificato le immagini con comete visibili distintamente.</li>
	</ol></li>
	<li>La versione base di ImageJ ha strumenti di avvio rappresentati come icone. Individua e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'icona con una linea per aprire un menu a discesa e seleziona la linea segmentata. Disegna la linea segmentata sulle regioni di interesse (ROI) con la sua origine su o vicino al corpo cellulare del neurone.<ol>
<li>Per considerazioni successive, salvare il ROI della linea segmentata tramite roi manager utilizzando il seguente flusso di lavoro: ImageJ > Analizza > Strumenti > ROI manager > Selezionare la traccia disegnata nell'immagine e fare clic su Aggiungi nella finestra ROI manager > Altro nella finestra ROI manager > Salva.</li>
	</ol></li>
	<li>Prima di generare il kymograph, poiché le scale spaziali e temporali sono diverse, rimuovere il ridimensionamento per ottenere le misurazioni in pixel utilizzando quanto segue: ImageJ > Analizza > Imposta scala > Fare clic per rimuovere la scala > OK.</li>
	<li>Utilizzando la funzione Reslice nel menu a discesa Image > Stacks, generare un kymograph. Il kymograph è una rappresentazione del ROI segmentato nel tempo. L'asse orizzontale rappresenta la distanza e l'asse verticale rappresenta il tempo. Le tracce diagonali rappresentano le comete in movimento. Generalmente, il kymograph prende il profilo colore dell'immagine altrimenti assegna un profilo colore come descritto nei passaggi precedenti 5-6 per la visualizzazione delle tracce diagonali.</li>
	<li>Utilizzando la funzione Linea retta nel menu a discesa dello strumento Linea (fare riferimento al passaggio 9 di questa sezione) disegnare linee rette su ciascuna delle tracce diagonali e aggiungerle nel roi manager.</li>
	<li>Nella scheda Analizza, passare a Imposta misurazioni e selezionare i parametri Intensità media e Rettangolo limite per misurare le tracce.</li>
	<li>Nella finestra gestione ROI, fare clic su Misura che aprirà una finestra Risultato che produrrà l'intensità media del ROI, le coordinate X e Y delle tracce di linea, Larghezza, Altezza, Angolo e Lunghezza delle tracce di linea. Questa finestra può essere salvata come formato .csv e successivamente importata in un programma di analisi dei dati.</li>
	<li>Nel programma del foglio di calcolo, si apre la finestra dei risultati con i valori distribuiti in righe e colonne. I valori rilevanti sono la larghezza, l'altezza e l'angolo delle tracce. La larghezza dà lo spostamento della traccia, l'altezza dà la durata e l'angolo rappresenta il vettore. Poiché i valori di larghezza e altezza sono in pixel, moltiplicarli per le scale spaziale e temporale, rispettivamente, per ottenere i parametri misurabili standard.</li>
	<li>Poiché il lato sinistro del chimografo è prossimale al corpo cellulare, a seconda dell'angolo, classificare le comete in plus-end-out o minus-end-out (cioè, lontano dal corpo cellulare o verso il corpo cellulare, rispettivamente). Classificare gli angoli compresi tra 1° e -89° e da -91° a -179° rispettivamente come plus-end-out e minus-end-out. Raccogli i dati di più kymographs in un foglio di calcolo per uno studio e rappresenta statisticamente.</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

La comprensione della dinamica dei microtubuli è stata un obiettivo chiave nel campo della ricerca citoscheletrica nel corso degli anni. I microtubuli subiscono nucleazione e catastrofe insieme a un processo continuo di instabilità dinamica44,45,46,47. Molte di queste informazioni sono state ottenute attraverso saggi in vitro come le lettura di diffusione della luce...

I neuroni hanno un'architettura elaborata con compartimenti specializzati come dendriti, corpi cellulari, assoni e sinapsi. Il citoscheletro neuronale è costituito dai microtubuli, microfilamenti e neurofilamenti e la loro organizzazione distinta supporta i compartimenti neuronali strutturalmente e funzionalmente1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Nel corso degli anni, l'organizzazione dei microtubuli è stata identificata come un determinante chiave della polarità e della funzione neuronale. Mentre i neuroni subiscono un rimodellamento strutturale durante lo sviluppo o la rigenerazione, la dinamica e l'orientamento dei microtubuli determinano l'identità, il trasporto polarizzato, la crescita e lo sviluppo di vari compartimenti neuronali7. È quindi imperativo valutare la dinamica dei microtubuli e l'orientamento in vivo per correlarsi con il processo di rimodellamento neuronale.
I microtubuli sono composti da protofilamenti di eterodimeri di α e β tubulina con estremità più dinamiche e estremità meno relativamente stabili11,12. La scoperta del complesso plus tip e delle proteine leganti l'estremità associate hanno permesso una piattaforma per valutare l'organizzazione dei microtubuli13. Le proteine leganti l'estremità (EBP) si associano transitoriamente alle estremità più crescenti del microtubulo e le loro dinamiche di associazione sono correlate alla crescita dei protofilamenti dei microtubuli14,15. A causa della frequente associazione e dissociazione del complesso plus tip con il microtubulo, la funzione di diffusione puntuale dell'EBP con tag GFP appare come una "cometa" in un film timelapse15,16. Dall'osservazione pionieristica nei neuroni dei mammiferi16,le proteine leganti le estremità marcate con proteine fluorescenti sono state utilizzate per determinare la dinamica dei microtubuli in diversi sistemi modello e tipi di neuroni17,18, 19,20,21,22,23.
Grazie al suo semplice sistema nervoso e al corpo trasparente, C. elegans ha dimostrato di essere un eccellente sistema modello per studiare il rimodellamento neuronale durante lo sviluppo e la rigenerazione in vivo. Qui descriviamo i metodi per etichettare, immaginare e analizzare le dinamiche e la crescita dei microtubuli durante lo sviluppo e la rigenerazione dei touch neuroni in C. elegans. Utilizzando EBP-2::GFP geneticamente codificato, abbiamo ripreso i microtubuli nel neurone PLM, che ci ha permesso di determinare la polarità dei microtubuli in due diversi neuriti di questo neurone24. Questo metodo consente l'osservazione e la quantificazione delle comete EBP come misura della dinamica dei microtubuli in diversi contesti cellulari, ad esempio, i cambiamenti locali nel comportamento dei microtubuli che avviano la rigenerazione degli assoni dopo l'assotomia possono essere valutati utilizzando il nostro protocollo. Questo test può essere adattato per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli in vari processi cellulari in diversi tipi di cellule e background genetici.

<table><tbody><tr><td>CZ18975 ceppo di vermi</td><td>Yishi Jin lab</td><td>CZ18975</td><td>Generato da Anindya Ghosh-Roy</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Montaggio di vermi</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti (18 mm x 18 mm)</td><td>Zeiss</td><td>474030-9010-000</td><td>Montaggio di vermi</td></tr><tr><td>Bagno secco con blocco riscaldante</td><td>Neolab</td><td></td><td>Montaggio di vermi Vetrini</td></tr><tr><td>di vetro (35 mm x 25 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td>Vermi di montaggio Soluzione</td></tr> di <tr><td>perline di polistirene (4,55 x 10^13 particelle/ml in mezzo acquoso con tensioattivo minimo)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876</td><td>Montaggio di vermi Provette</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Montaggio di vermi</td></tr><tr><td>OP50 ceppo</td><td>batterico Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td>Manipolazione di vermi</td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 60 mm</td><td>Praveen Scientific</td><td>20440</td><td>Manipolazione di vermi</td></tr><tr><td>Aspiratore/Capillare</td><td>VWR</td><td>53432-921</td><td>Manipolazione di vermi</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Panasonic</td><td>MIR554E</td><td>Manipolazione di viti Filo</td></tr><tr><td></td><td></td><td>di platino</td><td>Manipolazione di viti senza fine</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio con attacco a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td>Manipolazione di viti</td></tr><tr><td>0,3% Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>Terreno di crescita dei nematodi</td></tr><tr><td>0,25% Peptone</td><td>T M Terreno</td><td>1506</td><td>Terreno di crescita dei nematodi</td></tr><tr><td>10 mg/mL Colesterolo</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Terreno di crescita dei nematodi</td></tr><tr><td>1mM Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td>Terreno di crescita dei nematodi</td></tr><tr><td>1mM Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>Terreno di crescita dei nematodi</td></tr><tr><td>2% Agar</td><td>T M Media</td><td>1202</td><td>Terreno di crescita dei nematodi</td></tr><tr><td>25mM Fosfato monobasico di potassio diidrogeno</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>Terreno di crescita dei nematodi</td></tr><tr><td>0,1 M Potassio monobasico diidrogeno fosfato</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>1X M9 tampone</td></tr><tr><td>0,04 M Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>1X M9 tampone</td></tr><tr><td>0,1 M Cloruro di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>21405</td><td>1X M9 tampone</td></tr><tr><td>0,2 M Dibasico Disodio idrogeno fosfato eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td>1X M9 tampone</td></tr><tr><td>Bottiglie di vetro</td><td>Borosil</td><td></td><td>Buffer storage</td></tr><tr><td>laser 488 nm</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging 5X obiettivo</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>63X obiettivo</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Photometrics</td><td>Evolve 512 Delta</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sistema informatico per unità Spinning Disk</td><td>HP</td><td>Intel &reg; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Observer.Z1</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Lampada alogena</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Mercury Arc Lamp</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Spinning Disk Unit</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN2 software</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Image J (Figi Versione)</td><td></td><td></td><td>Analisi ed elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Adobe Creative Cloud</td><td>Adobe</td><td></td><td>Analisi ed elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Sistema informatico per l'analisi delle immagini</td><td>Dell</td><td>Intel &reg; Nucleo e commercio; i7-9700 CPU 3.00GHz</td><td>Elaborazione/Rappresentazione delle immagini</td></tr></tbody></table>

in vivo valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

Nei neuroni, l'orientamento dei microtubuli è stato un valutatore chiave per identificare gli assoni che hanno microtubuli e dendriti plus-end che generalmente hanno un orientamento misto. Qui descriviamo i metodi per etichettare, immaginare e analizzare le dinamiche e la crescita dei microtubuli durante lo sviluppo e la rigenerazione dei touch neuroni in C. elegans. Utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificati di punte di microtubuli, abbiamo ripreso i microtubuli assonali. I cambiamenti locali nel comportamento dei microtubuli che avviano la rigenerazione degli assoni dopo l'assotomia possono essere quantificati utilizzando questo protocollo. Questo test è adattabile ad altri neuroni e background genetici per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli in vari processi cellulari.

Come esempio rappresentativo, abbiamo descritto l'osservazione in vivo delle comete EBP nello stato stazionario e gli assoni rigeneranti dei neuroni PLM. I neuroni PLM si trovano nella regione della coda del verme con un lungo processo anteriore che forma una sinapsi e un breve processo posteriore. I neuroni PLM crescono nella direzione anteriore-posteriore vicino all'epidermide e sono responsabili della delicata sensazione di tocco nei vermi. A causa della loro struttura semplificata e della suscettibilità all'imaging e...

È stato presentato un protocollo per l'imaging dei microtubuli dinamici in vivo utilizzando una proteina legante finale etichettata fluorescentemente. Abbiamo descritto i metodi per etichettare, immaginare e analizzare i microtubuli dinamici nel neurone del microtubulo laterale posteriore (PLM) di C. elegans.

In vivo Valutazione della dinamica e dell'orientamento dei microtubuli nei neuroni della caenorhabditis elegans

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

L'obiettivo di questa procedura è valutare l'organizzazione e la dinamica dei microtubuli in vivo. I neuroni sono cellule polarizzate con compartimenti assonali, dendritici e sinaptici distinti, mantenuti dal loro citoscheletro sottostante. I microtubuli formano la maggior parte del citoscheletro neuronale e la dinamica e l'orientamento determinano eventi chiave durante lo sviluppo e la maturazione neuronale.I microtubuli sono composti da eterodimeri alfa e beta tubulinica e sono intrinsecamente polarizzati con estremità più altamente dinamiche e estremità inferiori stabili. Durante la polimerizzazione alle estremità più, un complesso multimolerele di proteine leganti l'estremità, si associa transitoriamente ai protofilamenti e promuove l'assemblaggio di dimeri di tubulina. Questa tecnica ci aiuterà a visualizzare i microtubuli neurali in vivo.Usando questa tecnica, si può determinare l'orientamento e altri parametri dei microtubuli dinamici durante lo sviluppo e la rigenerazione del neurone C.elegans. In genere usiamo questo reporter per visualizzare la dinamica dei microtubuli nel neurone sensoriale. Tuttavia, si può esprimere questo reporter in altri tipi di cellule come muscoli e pelle per visualizzare microtubuli dinamici in queste cellule.Le proteine che legano le estremità etichettate fluorescentmente come EBP a GFP qui, appaiono come comete. La dinamica di queste comete è stata correlata con la crescita concomitante dei microtubuli e un indicatore chiave per misurare la dinamica e l'orientamento dei microtubuli. Per osservare queste comete in un tipo di cellula specifico, il transgene con DNA di EBP-2 e GFP è espresso sotto un promotore specifico.Per l'espressione nei neuroni PLM, questo transgene è espresso sotto il make for promoter. Questi vermi transgenici possono essere visualizzati al microscopio stereo, con fluorescenza impostata prima dello smistamento o del montaggio. Per il montaggio dei worm per l'imaging delle comete EBP, realizziamo un Argos al 10% in un buffer M9.e posizionare una goccia su un vetrino. Un'altra diapositiva viene utilizzata per premere la goccia in un film che si solidifica in un pad. Usiamo 0,1 micron, perline di polistirene come mezzo di montaggio, alcuni vermi vengono raccolti e ri-sospesi nella soluzione di perline.Una scivolata di copertura viene bracconata per immobilizzare i vermi e presa per l'imaging. Quelli montati possono essere ripresi su qualsiasi microscopio a fluorescenza con una telecamera per l'imaging ad alta risoluzione. La configurazione è dotata di un'unità disco rotante per un'acquisizione più rapida e una riduzione dello sbiancamento fotografico e della fototossicità.La diapositiva viene mantenuta sul palco e il campo dei vermi è focalizzato e centrato utilizzando l'illuminazione a campo luminoso. Un obiettivo a basso ingrandimento come 5X o 10X può essere utilizzato per questo scopo. I worm possono essere rimessi a fuoco con un obiettivo di ingrandimento elevato come 63X utilizzando la stessa illuminazione.Questo obiettivo fornisce una risoluzione spaziale ottimale per l'imaging delle comete. Un centraggio fisso del neurone PLM viene eseguito sotto l'illuminazione a fluorescenza per prevenire l'eccessiva esposizione alla luce e lo sbiancamento fotografico del prum. Per l'acquisizione delle immagini utilizziamo software di invio fuori siti.Utilizzando la configurazione di imaging dal vivo nel canale brightfield, focalizzamo la regione di coda del worm e la centriamo nel campo visivo. Questo è seguito dalla messa a fuoco del neurone PNM utilizzando la configurazione di imaging della luce con luce di eccitazione a 488 nanometri. Per un'acquisizione time-lapse, viene creata un'impostazione sperimentale in cui il tempo di esposizione, la durata del time lapse e l'intervallo tra i fotogrammi definiscono le abilità temporali dell'imaging.Per le misurazioni quantitative alcuni filmati di comete EBP devono essere analizzati su Image J, che è un software open source. Il time-lapse acquisito si apre come un filone multi-immagine, che può essere visualizzato in anteprima come filmato. In questo particolare lasso di tempo, le comete possono essere viste nel corpo cellulare, nel processo anteriore e posteriore del neurone PLM.Le comete che si allontanano dal corpo cellulare sono classificate come plus-end-out, e quelle che si muovono verso il corpo cellulare sono classificate come minus-end-out. Per iniziare l'analisi viene tracciata una linea segmentata sulla regione di interesse, che in questo caso è il processo interno del neurone PLM. Questo segmento di linea viene convertito in un kymograph utilizzando la funzione di reslice delle immagini.Un kymograph è un'immagine temporale a distanza con pieghe diagonali che rappresentano le comete in movimento. Su queste tracce è possibile disegnare segmenti rettilinei e impostare parametri di misurazione utilizzando il menu analizza. Questi parametri possono essere convertiti in quantità e unità misurabili standard nel programma di analisi dei dati come Excel.La larghezza della traccia corrisponde alla lunghezza di crescita. L'altezza rappresenta la durata della crescita e l'angolo della piega dà la direzione delle comete. Queste comete possono essere ulteriormente classificate in plus-end-out e minus-end-out, per trovare l'orientamento relativo dei microtubuli.L'espressione transgenica di EBTA GFP può essere adattata per osservare la dinamica dei microtubuli in vari contesti cellulari, come la nuova rigenerazione. Per osservare la dinamica dei microtubuli negli assoni di valutazione della regione, l'assone viene ferito utilizzando un laser a femtosecondi, che può recise l'assone con precisione senza causare enormi danni collaterali. Dopo l'infortunio, i vermi possono essere recuperati su piastre del motore seminate per osservazioni successive.I neuroni PLM mostrano una robusta rigenerazione esonero, che può essere osservata già sei ore dopo l'infortunio. Per prevenire la fototossicità per rigenerare nuovi diritti, l'imaging dal vivo viene eseguito in un microscopio a disco rotante. Le acquisizioni time-lapse degli assoni rigeneranti possono essere successivamente convertite in chimografi per l'analisi delle comete.La durata della distanza e la direzione delle comete possono quindi essere interpretate in termini di orientamento e dinamica dei microtubuli. Il mio orientamento critico e le mie dinamiche sono determinanti chiave dei processi cellulari civili come la divisione cellulare, la migrazione e il mantenimento dell'architettura cellulare. Sebbene ci siano molti strumenti disponibili per la misurazione della dinamica dei microtubuli, la misurazione in vivo può essere impegnativa.L'autofiorescenza, la fototossicità, l'artefatto di sovraespressione e le intensità variabili riportate sono alcune delle difficoltà incontrate durante l'osservazione dal vivo delle proteine leganti l'estremità, per valutare la dinamica dei microtubuli. Utilizzando un transgenico integrato con bassa concentrazione di DNA deportato e immagini a bassa illuminazione, questo studio ha affrontato metodi per mitigare alcune di queste sfide. I moduli di imaging e analisi qui descritti possono essere estesi ad altri reporter basati su microtubuli e al trasporto di proteine.Questo non è applicabile solo ai neuroni C.elegance, ma può essere applicato ad altri tipi di cellule e sistemi modello.

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