Name: Un modello murino in vivo di anestesia endovenosa totale durante la chirurgia di resezione del cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Scopri un protocollo di anestesia endovenosa totale con propofolo in modelli murini di chirurgia oncologica. Questo metodo permette di studiare gli effetti dell'anestesia sulla recidiva tumorale a breve e lungo termine.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del Cancer Neural-Immune Laboratory e il Dr. Cameron Nowell del Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, Parkville. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Health and Medical Research Council 1147498, della National Breast Cancer Foundation IIRS-20-025, dell'Australian and New Zealand College of Anaesthetists (ANZCA), Perpetual e CTC for Cancer Therapeutics.

Tutti gli studi sugli animali sono stati intrapresi sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Monash University. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina Balb / c di età compresa tra 6 e 8 settimane.
1. Preparare le cellule tumorali
<ol><li>Coltura di cellule tumorali in mezzo. Coltura 66cl4 di cellule tumorali mammarie murine in alfa-MEM contenenti il 10% di FBS e 200 mM di glutammina. Le cellule dovrebbero risultare negative per il micoplasma. OPZIONALE: Utilizzare cellule che sono stabilmente trasdotte per esprimere la luciferasi della lucciola per l'imaging a bioluminescenza per consentire il monitoraggio delle recidive del cancro dopo l'intervento chirurgico di resezione11 (vedere il passaggio 4). NOTA: La linea cellulare e il mezzo sopra menzionati sono stati utilizzati in questo studio.</li>
	<li>Crescere cellule a 37 °C con il 5% di CO2. Celle di passaggio asetticamente in una cappa a <80% di confluenza. Utilizzare celle a basso passaggio nella fase di crescita logaritmica per risultati ottimali in vivo .</li>
	<li>Sollevare le cellule aderenti con 0,5 mg / ml di tripsina in PBS con 10 mM EDTA; 2 mL per un matraccio T75. Una volta sollevato, aggiungere mezzo per inattivare la tripsina e lavare le cellule in PBS.</li>
	<li>Contare le cellule usando un emocitometro. Diluire le cellule in PBS per iniezione. Per 66cl4 cellule tumorali mammarie, iniettare 1 x 105 cellule in 20 μL di PBS per topo.</li>
	<li>Posizionare le cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione.</li>
</ol>2. Generare un modello murino di cancro al seno
<ol><li>Utilizzare isoflurano al 4% per anestetizzare il topo in una camera di induzione. Quindi, mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% -3% usando un cono nasale. Confermare la corretta anestetizzazione per mancanza di risposta al pizzico del piede.</li>
	<li>Preparare il sito di iniezione pulendo la quarta area del grasso mammario sinistro utilizzando un tampone imbevuto di alcol monouso.</li>
	<li>Aspirare le cellule tumorali (vedere punto 1.4) in una siringa di Hamilton da 25 μL attaccata a un ago ipodermico sterile da 27 G.</li>
	<li>Iniettare le cellule nel quarto adiposo mammario sinistro. Utilizzare una pinza per fissare e sollevare la pelle. Iniettare circa 1 mm dal capezzolo.</li>
	<li>FACOLTATIVO: Se le cellule sono contrassegnate con luciferasi, confermare il successo dell'iniezione di cellule tumorali mediante imaging a bioluminescenza. Iniettare 100 μL di 150 mg/kg di D-luciferina nella vena laterale della coda dei topi anestetizzati usando una siringa da insulina da 0,5 mL con un ago ipodermico da 30 G.</li>
	<li>OPZIONALE: Posizionare il mouse in un sistema di imaging a bioluminescenza con il cuscinetto di grasso mammario rivolto verso l'alto. Attendere 2 minuti dall'iniezione di luciferina per un assorbimento ottimale dei tessuti di luciferina, quindi immagine per 10 s.</li>
	<li>Metti il mouse in una gabbia pulita e lascialo guarire dall'anestesia.</li>
	<li>Continuare a monitorare il benessere degli animali secondo le linee guida istituzionali sull'etica animale.</li>
</ol>3. Indurre l'anestesia stabile con somministrazione endovenosa di propofol
<ol><li>Monitorare la crescita del tumore primario utilizzando la misurazione del calibro e calcolare il volume del tumore utilizzando l'equazione: Volume (mm3) = (lunghezza x (larghezza)2 ÷ 2 ).</li>
	<li>Eseguire un intervento chirurgico di resezione tumorale sui topi quando il tumore primario raggiunge il volume richiesto (qui, 80-90 mm3).</li>
	<li>Installare una pompa automatica a siringa con una siringa da insulina da 30 G 1 mL contenente la formulazione di propofol (2% di Lipuro propofol) (Figura 1A).</li>
	<li>Indurre l'anestesia del topo in una camera di induzione con sevoflurano o isoflurano al 3%. NOTA: Qui, il sevoflurano è stato usato in quanto questo è il volatile predominante usato clinicamente.</li>
	<li>Trasferire il mouse su una piastra riscaldante a 37 °C per tutta la durata dell'intervento. Mantenere brevemente l'anestesia con sevoflurano al 2% -3% usando un cono nasale.</li>
	<li>Applicare lubrificante acquoso sugli occhi per prevenire l'essiccazione.</li>
	<li>Iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea per l'analgesia.</li>
	<li>Per prepararsi alla chirurgia, radersi l'addome e preparare la pelle per l'intervento chirurgico con una soluzione di iodio-povidone. Pulire la pelle con alcool o salvietta sterile.</li>
	<li>Per erogare TIVA a base di propofol, cannulare la vena laterale della coda utilizzando un ago ipodermico sterile da 30 G collegato a un catetere sterile in poliuretano. Confermare il corretto posizionamento mediante flashback di sangue nel catetere (Figura 1B). Regolare l'erogazione di sevoflurano come richiesto durante l'incannulamento endovenoso per mantenere una profondità stabile dell'anestesia dimostrata dalla perdita del riflesso corneale e del pedale e la frequenza respiratoria < 100 respiri al minuto.</li>
	<li>Iniziare propofol-TIVA somministrando propofol al 2% come bolo iniziale di 27 mg/kg per oltre 1 minuto. Cessare la somministrazione di sevoflurano.</li>
	<li>Continuare l'infusione di propofol ad una velocità di mantenimento di 2,2-4,0 mg/kg/min per mantenere una profondità stabile dell'anestesia per tutta la durata dell'intervento chirurgico (Figura 1C).</li>
</ol>4. Resecare il tumore primario
<ol><li>Fai un'incisione dritta di 1 cm inferiore al tumore nella regione del quarto grasso mammario sinistro. Resecare attentamente il tumore e il linfonodo inguinale sinistro usando la dissezione con una pinza smussata.</li>
	<li>FACOLTATIVO: Se si utilizzano cellule tumorali marcate con luciferasi, utilizzare l'imaging a bioluminescenza per confermare chiari margini chirurgici. Iniettare 150 mg/kg di D-luciferina nella vena laterale della coda, attendere 2 minuti, quindi visualizzare l'immagine per 60 s utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza. Se viene identificato un tumore residuo, resecare il tessuto aggiuntivo dal cuscinetto di grasso mammario e ri-immagine per ottenere margini chiari.</li>
	<li>Assicurarsi l'emostasi nel sito chirurgico e chiudere la pelle utilizzando suture di nylon 5-0. Assicurarsi che la pelliccia non entri nel sito chirurgico.</li>
	<li>Al termine dell'intervento chirurgico di resezione, interrompere l'anestesia. Mettere il topo in una gabbia pulita su una piastra riscaldante a 37 °C e lasciarlo guarire dall'anestesia.</li>
	<li>Monitorare ogni 15 minuti dopo l'anestesia fino a quando il mouse non è tornato alla normale vigilanza. Quindi, monitorare il mouse ogni 12 ore per 48 ore dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Somministrare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea ogni 12 ore per 48 ore dopo l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Dopo 7-10 giorni, rimuovere le suture usando tronchesi sterili a punto curvo in anestesia breve con sevoflurano o isoflurano.</li>
</ol>5. Traccia la recidiva del cancro con l'imaging in vivo
<ol><li>Utilizzare l'imaging a bioluminescenza per monitorare la recidiva del cancro dopo l'intervento chirurgico di resezione in modo non invasivo. Utilizzare un sistema di imaging a bioluminescenza per monitorare i topi una volta alla settimana per l'evidenza di recidiva del tumore primario o recidiva a distanza, a partire dalla settimana successiva all'intervento chirurgico.</li>
	<li>Indurre l'anestesia del topo in una camera di induzione con isoflurano al 4%. Quindi, trasferire il mouse su una piastra riscaldante a 37 °C per tutta la durata dell'anestesia e mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% -4% utilizzando un cono nasale.</li>
	<li>Applicare lubrificante acquoso sugli occhi per prevenire l'essiccazione.</li>
	<li>Iniettare D-luciferina 150 mg/kg nella vena laterale della coda. Attendere 2 minuti, quindi misurare la bioluminescenza su un'esposizione di 60 s per rilevare la recidiva del tumore primario o metastasi a distanza.</li>
	<li>Se il tumore primario si ripresenta e diventa palpabile, iniziare il monitoraggio della crescita tumorale utilizzando misurazioni del calibro.</li>
	<li>Alla fine dell'esperimento, uccidere umanamente i topi secondo il protocollo approvato. Qui è stata utilizzata la CO2 , seguita dalla dislocazione cervicale.</li>
</ol>

<ol><li>Sullivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+surgery%3A+delivering+safe%2C+affordable%2C+and+timely+cancer+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Global cancer surgery: delivering safe, affordable, and timely cancer surgery.</a> Lancet Oncology. 16 (11), 1193-1224 (2015).</li>
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<li>Hiller, J. G., Perry, N. J., Poulogiannis, G., Riedel, B., Sloan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+events+influence+cancer+recurrence+risk+after+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Perioperative events influence cancer recurrence risk after surgery.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (4), 205-218 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Questo studio riporta un protocollo per la somministrazione di anestesia endovenosa totale (TIVA) con propofol in un modello murino di cancro al seno che replica aspetti chiave della pratica clinica per TIVA in pazienti che richiedono un intervento chirurgico per il cancro. Il protocollo consente di studiare gli esiti clinicamente rilevanti sia a breve che a lungo termine dopo la chirurgia del cancro in un modello murino di progressione del cancro, compresa la misurazione dei livelli di citochine e della recidiva del can...

Oltre il 60% dei pazienti con cancro riceve l'anestesia per la resezione chirurgica1. Attualmente, non ci sono linee guida cliniche specifiche che determinano la scelta dell'anestesia utilizzata nei pazienti oncologici. Le indagini sugli anestesisti indicano una preferenza per l'anestesia su base volatile, anche durante la chirurgia del cancro 2,3. Tuttavia, vi è un crescente numero di prove che l'uso dell'anestesia endovenosa totale (TIVA) a base di propofol durante la chirurgia del cancro può associarsi a migliori risultati postoperatori (sopravvivenza libera da progressione, sopravvivenza globale) rispetto all'anestesia volatile4. Studi clinici successivi continuano a riportare risultati contraddittori 5,6,7,8. Questi risultati supportano la necessità di studi preclinici per comprendere meglio gli effetti meccanicistici di diversi agenti anestetici sugli esiti correlati al cancro.
Tuttavia, negli studi in vivo che modellano la chirurgia del cancro, l'anestesia è spesso una parte incidentale della procedura. Il razionale per la scelta dell'anestesia spesso non è al centro del disegno sperimentale e il suo impatto sugli endpoint correlati al cancro potrebbe non essere valutato. Ad esempio, gli studi in vivo che richiedono il mantenimento dell'anestesia per la chirurgia del cancro usano più comunemente l'anestesia volatile inalatoria9. Laddove il propofol è stato utilizzato in studi in vivo, è stato somministrato mediante somministrazione in bolo singolo con somministrazione intraperitoneale, che non replica i protocolli clinici onco-anestesici10. Questo approccio di somministrazione di propofol induce un'anestesia leggera adatta per procedure rapide. Tuttavia, non consente il mantenimento dell'anestesia necessaria per la chirurgia di resezione del cancro che può essere protratta. Inoltre, la cinetica di assorbimento della somministrazione intraperitoneale è distinta dai metodi clinici di somministrazione.
Un modello di TIVA a base di propofol per la chirurgia della resezione del cancro è stato sviluppato per soddisfare questa esigenza. È stato sviluppato un protocollo per il mantenimento prolungato dell'anestesia con titolazione dell'agente anestetico per consentire la risposta allo stimolo chirurgico per replicare gli aspetti chiave della somministrazione di anestetico ai pazienti sottoposti a chirurgia oncologica. Il protocollo risultante viene utilizzato con un modello murino di cancro per fornire TIVA durante la chirurgia di resezione del cancro. Viene valutato l'effetto sugli esiti correlati al cancro a breve e lungo termine.

<table><tbody><tr><td>0,9% soluzione salina</td><td>Fresnius Kabi</td><td>AUST R 197198</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per arteria</td><td>Proscitech</td><td>TS1322-140</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Temgesic</td><td>TEMG I</td><td></td></tr><tr><td>Tappetino chirurgico riscaldato</td><td>Ago</td><td></td> ipodermico personalizzato <td></td></tr><tr><td>(30 G, 1 mL siringa da insulina)</td><td>Terumo</td><td>NN3013R</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td>126274</tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041/2/3</td><td></td></tr><tr><td>Catetere in poliuretano</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodio</td><td>Betadine</td><td>AUST R 29562</td><td></td></tr><tr><td>Propofol Lipuro, 2%</td><td>Braun</td><td>3521490</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Baxter</td><td>ANZ2L9117</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizzatore di sevoflurano</td><td>Vetquip</td><td>VQ1334</td><td></td></tr><tr><td>Garza sterile</td><td>Multigate Medical Products</td><td>11-600A</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Proscitech</td><td>TS1044</td><td></td></tr><tr><td>Suture, 5-0 nylon</td><td>Dynek</td><td>V504</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe (1 mL)</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello murino in vivo di anestesia endovenosa totale durante la chirurgia di resezione del cancro

An In Vivo Mouse Model of Total Intravenous Anesthesia During Cancer Resection Surgery

L'anestesia è una componente di routine della cura del cancro che viene utilizzata per le procedure diagnostiche e terapeutiche. La tecnica anestetica è stata recentemente implicata nell'influenzare gli esiti del cancro a lungo termine, probabilmente attraverso la modulazione delle risposte adrenergico-infiammatorie che influenzano il comportamento delle cellule tumorali e la funzione delle cellule immunitarie. Prove emergenti suggeriscono che l'anestesia endovenosa totale (TIVA) basata su propofol può essere utile per gli esiti del cancro a lungo termine rispetto all'anestesia volatile per via inalatoria. Tuttavia, i risultati clinici disponibili sono incoerenti. Gli studi preclinici che identificano i meccanismi sottostanti coinvolti sono fondamentali per guidare la progettazione di studi clinici che accelereranno l'approfondimento. La maggior parte dei modelli preclinici di anestesia sono stati estrapolati dall'uso dell'anestesia nella ricerca in vivo e non sono progettati in modo ottimale per studiare l'impatto dell'anestesia stessa come endpoint primario. Questo articolo descrive un metodo per somministrare l'anestesia propofol-TIVA in un modello murino di resezione del cancro al seno che replica aspetti chiave del parto clinico nei pazienti oncologici. Il modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi d'azione dell'anestesia sugli esiti del cancro in diversi tipi di cancro e può essere estrapolato ad altre aree non tumorali della ricerca anestesiologica preclinica.

Questo metodo descrive un modello di anestesia endovenosa totale (TIVA) con propofol durante la chirurgia di resezione del cancro nei topi. Propofol viene somministrato in questo modello murino attraverso un catetere endovenoso utilizzando una pompa a siringa (Figura 1A,B) per replicare la somministrazione di TIVA nel contesto clinico dell'anestesia per la chirurgia del cancro. L'uso della pompa a siringa riduce al minimo l'esposizione all'anestesia volatile consentendo una ...

Questo articolo descrive un metodo per modellare l'anestesia endovenosa totale (TIVA) durante la chirurgia di resezione del cancro nei topi. L'obiettivo è replicare le caratteristiche chiave della somministrazione di anestesia ai pazienti con cancro. Il metodo consente di indagare su come la tecnica anestetica influisce sulla recidiva del cancro dopo l'intervento chirurgico di resezione.

Un modello murino in vivo di anestesia endovenosa totale durante la chirurgia di resezione del cancro

Anesthesia is a routine component of cancer care that is used for diagnostic and therapeutic procedures. The anesthetic technique has recently been ...

Questo nuovo protocollo descrive l'anestesia chirurgica nei topi usando l'anestesia propofol. Il metodo consente la ricerca sull'anestesia con propofol in modelli murini di malattia. Il protocollo consente la valutazione dell'anestesia endovenosa totale ed evita l'uso dell'anestesia volatile.Il protocollo può essere utilizzato per esplorare come l'anestesia con propofol influisce sugli esiti correlati alla malattia. Ad esempio, qui valutiamo gli esiti del cancro a breve e lungo termine dopo l'intervento chirurgico per rimuovere il tumore. Per iniziare, coltura 66 CL4 Mirai cellule tumorali mammarie che sono stabilmente trasdotte per esprimere lucciola luciferasi in mezzo alfa MEM contenente 10% FBS e 200 millimolari glutammina.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius ma 5% di anidride carbonica. Subcoltura le cellule quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza. Quando le cellule sono in una fase di crescita logaritmica con due millilitri di gocce in soluzione di EDTA, sollevare le cellule aderenti e contare le cellule usando un emocitometro.Quindi diluire le cellule in PBS e mantenere la sospensione cellulare diluita sul ghiaccio fino a quando il topo è pronto per l'iniez

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In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Il presente protocollo descrive una resezione standardizzata dei tumori cerebrali nei roditori attraverso un approccio minimamente invasivo con un sistema integrato di conservazione dei tessuti. Questa tecnica ha implicazioni per rispecchiare accuratamente lo standard di cura nei roditori e in altri modelli animali.

Implementazione della resezione minimamente invasiva del tumore cerebrale nei roditori per la raccolta di tessuti ad alta vitalità

Scopri un protocollo di anestesia endovenosa totale con propofolo in modelli murini di chirurgia oncologica. Questo metodo permette di studiare gli effetti dell'anestesia sulla recidiva tumorale a breve e lungo termine.

Un modello murino in vivo di anestesia endovenosa totale durante la chirurgia di resezione del cancro

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