Name: Produzione rapida, economica e semplice di lisato privo di cellule batteriche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Scopri come produrre lisato batterico di alta qualità per espressione genica cell-free utilizzando Escherichia coli e attrezzatura standard. Questo metodo rapido ed economico rende l'espressione cell-free accessibile a tutti i ricercatori.

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Gli autori ringraziano Zachary Sun e Richard Murray (California Institute of Technology) per aver gentilmente fornito il plasmide P_araBAD-gamS, e Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) per aver gentilmente fornito una centrifuga di raffreddamento ad alta velocità. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health e dal programma ARO MURI ed è stato in parte supportato dalla Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Giappone.

1. Preparare supporti e buffer.
<ol><li>Preparare 2xYTPG medio.<ol>
<li>Mescolare 62 g di polvere 2xYT, 5,99 g di fosfato di potassio monobasico, 13,93 g di fosfato di potassio bibasico e acqua deionizzata a 2 L.</li>
		<li>Autoclave su ciclo liquido con un tempo di esposizione di 30 min14.</li>
		<li>A 400 mL di 2xYTP media da 1.1.2, aggiungere 7,2 g di D-glucosio (destrosio) e mescolare fino a quando non si scioglie.</li>
		<li>Filtrare-sterilizzare attraverso un filtro da 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il buffer S30A.<ol>
<li>Mescolare Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM di concentrazione finale), glutammato di potassio (60 mM finale) e glutammato di magnesio (14 mM finale).</li>
		<li>Regolare il pH a 7,7 utilizzando 10 M KOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione 1 (vedere Tabella 1).<ol>
<li>Sospendere l'acido 4-(2-idrossietil)-1- piperazineetanosolfonico (HEPES) in 2 ml di acqua.</li>
		<li>Regolare il pH a 8,0 usando KOH.</li>
		<li>Aggiungere tutti gli altri componenti dalla Tabella 1.</li>
		<li>Regolare il pH a 7,6 utilizzando 10 M KOH. Filtro-sterilizzare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una soluzione premiscelata 2,5x (vedere Tabella 2).<ol>
<li>Mescolare tutti i componenti nella Tabella 2.</li>
		<li>Regolare il pH a 7,5 utilizzando KOH.</li>
		<li>Aliquota e congelamento a -80 °C. NOTA: una reazione da 20 μL utilizza 8,9 μL di premiscela.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparare le cellule.
<ol><li>Strisciare le cellule autolizzate su piastre di agar LB contenenti ampicillina da 50 μg/mL utilizzando un ciclo inoculante e crescere a 37 °C (vedere Nota 1).</li>
	<li>Scegliere una singola colonia in una coltura iniziale di LB/ampicillina media usando una punta di pipetta e crescere a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Inoculare 400 mL di terreno 2xYTPG contenente ampicillina da 50 μg/mL con 400 μL di coltura iniziale e crescere a 37 °C in un matraccio Erlenmeyer da 1 L, agitando a 300 giri/min.</li>
	<li>Misurare periodicamente la densità ottica della coltura a 600 nm (OD600) utilizzando uno spettrofotometro per leggere una cuvetta ottica con una lunghezza del percorso di 1 cm. Quando l'OD600 supera 1, iniziare a diluire la coltura 5 volte prima delle misurazioni per garantire che le misurazioni rimangano all'interno dell'intervallo lineare di un tipico spettrofotometro da laboratorio. Continuare a far crescere le cellule fino a quando la coltura diluita 5 volte raggiunge OD600 di 0,3 (corrispondente a una coltura OD600 di 1,5).</li>
</ol>3. Preparare il lisato.
<ol><li>Preparare il tampone S30A integrato con 2 mM di ditiotreitolo (DTT). Miscelare 3 mL di tampone S30A con 6 μL di soluzione madre DTT a 1 M. Posto su ghiaccio per l'uso nel passaggio 3.7.</li>
	<li>Raccogliere le cellule centrifugando a 1800 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare il surnatante versandolo e usando un pipetto per rimuovere il liquido rimanente.</li>
	<li>Risospendare il pellet in 45 mL di tampone freddo (4-10 °C) S30A utilizzando un miscelatore a vortice.</li>
	<li>Pesare un tubo centrifugo vuoto da 50 ml, trasferire le celle al suo interno e ripetere i passaggi 3.2-3.3 per lavare le celle.</li>
	<li>Pesare il pellet, sottraendo il peso di un tubo vuoto da 50 ml. Assicurarsi di aspirare accuratamente qualsiasi surnatante rimanente per garantire una misurazione accurata del peso del pellet. NOTA: Una resa tipica è di ~ 1,3 g di pellet cellulare da 400 ml di coltura di produzione.</li>
	<li>Aggiungere 2 volumi di tampone S30A freddo integrato con 2 mM di ditiotreitolo, cioè 2 mL di tampone per ogni 1 g di pellet cellulare, e risospesciare le cellule mescolando vigorosamente il vortice.</li>
	<li>Congelare le cellule. Posizionare il tubo da 50 ml contenente le celle in un congelatore a -20 °C o -80 °C fino a quando il pellet non è completamente congelato. NOTA: il passaggio di congelamento è un buon punto di arresto per la giornata.</li>
	<li>Scongelare le celle in un bagno d'acqua a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vortice vigoroso per 2-3 min.</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 45 minuti con agitazione a 300 giri/min.</li>
	<li>Eliminare il campione da detriti cellulari pesanti centrifugando in tubi centrifugati trasparenti a 30.000 × g per 45 minuti a 4 °C. NOTA: se non è disponibile una centrifuga capace di 30.000 x g, centrifugare per 45 minuti a 21.000 × ge prestare maggiore attenzione nel passaggio 3.13, poiché il pellet sarà meno compatto.</li>
	<li>Trasferire con cura il surnatante in un nuovo tubo con una pipetta, evitando di disturbare il più possibile il pellet. Se il surnatante trasferito è contaminato da materiale dal pellet, ripetere il passaggio precedente.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in tubi centrifughi da 1,5 mL e centrifugare ancora una volta a 21.000 × g (o la velocità massima di una centrifuga da tavolo) per 5 minuti.</li>
	<li>Aliquotare l'autolisi eliminata nei volumi desiderati, evitando accuratamente qualsiasi pellet rimanente, e congelare a -80 °C o utilizzare immediatamente. NOTA: Una singola reazione da 20 μL utilizza 8 μL di autolizzato.</li>
</ol>4. Espressione genica senza cellule
NOTA: l'autolizzato è ora pronto per qualsiasi uso finale desiderato. Di seguito è riportato un protocollo standard di esempio per l'espressione genica senza cellule.
<ol><li>Per una reazione di 20 μL, mescolare su ghiaccio 8 μL di autolizzato e 8,9 μL di premiscela. Vedi NOTA alla fine della sezione del protocollo riguardante l'ottimizzazione delle concentrazioni di glutammato magnesio e PEG 8000.</li>
	<li>Aggiungere DNA (ad esempio, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 a una concentrazione finale di 8 nM), qualsiasi altro reagente e acqua a 20 μL.</li>
	<li>Posizionare la reazione in una micropiastra a 384 pozzetti e misurare il decorso temporale di fluorescenza e/o gli endpoint utilizzando un lettore di piastre. Per la proteina fluorescente verde (GFP), utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nm.</li>
</ol>5. Modifiche del protocollo
Nota : le seguenti modifiche del protocollo consentono di servire altre applicazioni.
<ol><li>Espressione genica senza cellule utilizzando modelli di DNA lineare<ol>
<li>Eseguire i passaggi di cui al paragrafo 4, integrando la reazione con una proteina GamS purificata da 2,2 μM (espressa e purificata come descritto12)prima dell'aggiunta del DNA lineare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Espressione genica priva di cellule che incorpora la degradazione proteica<ol>
<li>Nel passaggio 2.1, utilizzare cellule autolizzate contenenti il plasmide pACYC-FLAG-dN6-His (vedere la tabella dei materiali). In tutti i mezzi di crescita, includono anche 34 μg / mL di cloramfenicolo.</li>
		<li>Nella fase 2.3, includere 40 μM isopropil β-D-1-tiogalattopoliranoside (IPTG) nel mezzo di crescita per indurre l'espressione dal plasmide.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.2-3.4 (lavaggio) altre due volte (per un totale di tre lavaggi) per garantire la completa rimozione del cloramfenicolo, che è un inibitore della traduzione. Per i primi due lavaggi (fase 3.4), sostituire il tampone S30A con soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7.4).</li>
		<li>Nel passaggio 4.2, integrare con un ulteriore 3 mM di ATP (aggiunto da una soluzione madre di 100 mM di ATP in acqua, pH 7,2) e 4,5 mM di glutammato di magnesio (utilizzando una soluzione madre da 1 M in acqua) (concentrazioni finali) per compensare l'elevato uso di ATP da parte di ClpXP, nonché la chelazione del magnesio da parte dell'ATP aggiuntivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Espressione genica senza cellule mediante letture basate su LacZ (inclusa colorimetrica)<ol>
<li>Nel passaggio 2.1, utilizzare celle autolizzate che non esprimono nativamente LacZ (vedere la tabella dei materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>In alternativa, preparare il lisato direttamente dalle cellule liofilizzate.<ol>
<li>Eseguire tutti i passaggi dalla versione 1.1 alla versione 3.7.</li>
		<li>Miscelare 8 μL di sospensione cellulare con 8,9 μL di premiscela.</li>
		<li>Aggiungere DNA plasmidico (se lo si desidera), altri reagenti personalizzati e acqua per raggiungere un volume finale di 20 μL.</li>
		<li>Trasferire la reazione su una micropiastra a 384 pozzetti e liofilizzarla. NOTA: i campioni liofilizzati possono essere conservati per un massimo di una settimana e possibilmente più a lungo.</li>
		<li>Per iniziare la reazione, reidratarla con 18 μL di acqua deionizzata integrata con qualsiasi DNA desiderato o altri reagenti.</li>
		<li>Segui le dinamiche di fluorescenza in un lettore di lastre.</li>
	</ol>
</li>
</ol>NOTA 1: Le cellule autolizzate sono progettate per lisare in un ciclo di congelamento-disgelo, quindi è particolarmente importante utilizzare il crioprotettore quando si producono scorte congelate. Abbiamo congelato le scorte al 24% di glicerolo wt/vol e le abbiamo conservate a -80 °C.
NOTA 2: Gli ioni di magnesio e PEG 8000 sono fondamentali per le prestazioni del lisato. La premiscela di base 2,5x, basata su dati precedentemente pubblicati, contiene 6 mM di glutammato di magnesio e 4,8% wt/vol PEG 8000, che diventano rispettivamente 2,4 mM e 1,9%, nella reazione finale. L'autolizzato preparato con il protocollo qui in genere funziona meglio con un ulteriore 5 mM Mg-glutammato e 1,5% PEG 8000 nella reazione finale. Tuttavia, questo può essere ottimizzato nell'intervallo di un ulteriore glutammato 0-10 mM Mg e un ulteriore 0-3% PEG 8000 (rispetto alla premiscela di base). Per preparare la premiscela con i raccomandati 5 mM di Mg-glutammato e 1,5% di PEG 8000 (concentrazioni finali), mescolare 380 μL di premiscela con 4,75 μL di glutammato di magnesio a 1 M e 36,1 μL di PEG 8000 al 40% peso/volume.

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</ol>

J.H. è co-fondatore di GenCirq Inc, che si concentra sulle terapie contro il cancro. Fa parte del Consiglio di amministrazione e ha partecipazioni in GenCirq.

Il protocollo qui descritto produce lisato batterico altamente attivo per l'espressione genica senza cellule. La chiave è utilizzare cellule portatrici del plasmide pAD-LyseR, che esprime citosolicamente l'endolisina del fago lambda. Queste cellule vengono potenziate per lisarsi dopo la permeabilizzazione della membrana interna, consentendo all'endolisina l'accesso alla parete cellulare, che il metodo ottiene attraverso un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Poiché le cellule si lisano efficacemente, il prodotto vien...

L'espressione genica nei lisati privi di cellule ha diversi vantaggi rispetto all'utilizzo di cellule vive1,2,3,4. I lisati possono essere facilmente modificati biochimicamente e utilizzati in condizioni che potrebbero essere dannose o impossibili da ottenere nelle cellule vive. I circuiti di espressione genica non devono competere o competere con i processi biologici dell'ospite e testare nuovi circuiti genetici è semplice come aggiungere DNA. Per questi motivi, l'espressione genica cell-free ha trovato varie applicazioni, dai biosensori5,6 alla prototipazione rapida di circuiti genici sintetici7,8 allo sviluppo di cellule artificiali9. La maggior parte dell'espressione genica senza cellule utilizza lisati cellulari che sono stati altamente elaborati, generalmente richiedendo protocolli lunghi e complessi, attrezzature specializzate e / o passaggi sensibili che possono portare a variazioni significative tra utenti e lotti10,11.
Questo documento descrive un metodo semplice ed efficiente per la produzione di lisato senza cellule che richiede un'elaborazione e un'esperienza minime (Figura 1A)12. Il metodo si basa su cellule di E. coli che sono progettate per lisare seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. Le cellule esprimono un'endolisina dal fago lambda che degrada la parete cellulare. Mentre le cellule crescono, questa endolisina rimane nel citoplasma, sequestrata dalla parete cellulare. Tuttavia, un semplice ciclo di congelamento-disgelo interrompe la membrana citoplasmatica, rilasciando l'endolisina nel periplasma, dove degrada la parete cellulare, con conseguente rapida lisi cellulare. Il protocollo può essere completato con poche ore di lavoro pratico e richiede solo un congelatore, una centrifuga capace di 30.000 × g (per risultati ottimali; velocità inferiori possono essere utilizzate con maggiore attenzione per non disturbare il pellet), un miscelatore a vortice e una semplice soluzione tampone. Il lisato funzionale può anche essere prodotto liofilizzando le cellule e reidratandole in situ. Tuttavia, questo metodo produce lisati con attività inferiore, presumibilmente a causa dei detriti cellulari rimanenti.
I lisati sono altamente attivi per l'espressione genica senza cellule e possono essere migliorati in vari modi a seconda dell'uso finale. La velocità di sintesi proteica può essere ulteriormente aumentata concentrando il lisato utilizzando concentratori di spin standard. Il DNA lineare può essere protetto dalla degradazione aggiungendo proteine GamS purificate. La degradazione delle proteine, necessaria per dinamiche circuitali più complesse come l'oscillazione, può essere ottenuta coesprimendo un esamere ClpX nel ceppo13produttore di autolizzato. Infine, le letture visive basate su LacZ sono abilitate utilizzando un ceppo autolizzato privo di lacZ. Nel complesso, questo metodo produce lisato privo di cellule altamente attivo che è adatto per una vasta gamma di applicazioni.

<table><tbody><tr><td>2xYT media</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8877</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-15, cutoff 3 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>opzionale, può essere utilizzato per concentrare il lisato, selezionare la capacità del concentratore appropriata per il volume da concentrare</td></tr><tr><td>ampicillina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>o carbenicillina, una variante più stabile</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>o cAMP equivalente</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>o</td></tr><tr><td>CoA</td> equivalente <td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>o CTP equivalente</td></tr><tr><td></td><td>United States Biosciences</td><td>14121</td><td>o</td></tr><tr><td>D-glucosio (destrosio) equivalente Fisher</td> <td>Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente ditiotreitolo (DTT)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente E. coli BL21-Gold (DE3) veicolante di pAD-LyseR,</td><td>Addgene</td><td>99244</td><td></td></tr>, <tr><td>E. coli, BL21-Gold (DE3) &; lacZ che trasporta pAD-LyseR,</td><td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr>, <tr><td>Acido folinico</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>o GTP</td></tr><tr><td></td><td>equivalente, United States Biosciences</td><td>16800</td><td>o HEPES equivalente</td>,</tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>o LB media equivalente</td></tr><tr><td></td>, <td>Fisher Scientific</td><td>DF0446075</td><td>o glutammato</td></tr> <tr><td></td><td>di magnesio equivalenteSigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente glutammato di potassio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G1501-100G</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente idrossido di potassio (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>per la regolazione del pH</td></tr><tr><td>fosfato di potassio bibasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>fosfato di potassio monobasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85558</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente miscela di tRNA</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td>o UTP equivalente</td></tr><tr><td></td><td>United States Biosciences</td><td>23160</td><td>o equivalente</td></tr></tbody></table>

produzione rapida, economica e semplice di lisato privo di cellule batteriche

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

L'espressione genica senza cellule offre il potere della biologia senza le complicazioni di un organismo vivente. Sebbene esistano molti di questi sistemi di espressione genica, la maggior parte sono piuttosto costosi da acquistare e / o richiedono attrezzature speciali e competenze finemente affinate per produrre in modo efficace. Questo protocollo descrive un metodo per produrre lisato batterico privo di cellule che supporta alti livelli di espressione genica, utilizzando solo apparecchiature di laboratorio standard e richiedendo un'elaborazione minima. Il metodo utilizza un ceppo di Escherichia coli che produce un'endolisina che non influisce sulla crescita, ma che lisa in modo efficiente un pellet cellulare raccolto seguendo un semplice ciclo di congelamento-disgelo. L'unica ulteriore elaborazione richiesta è una breve incubazione seguita da centrifugazione per eliminare l'autolizzato dai detriti cellulari. I circuiti genici dinamici possono essere ottenuti attraverso l'espressione eterologa della proteasi ClpX nelle cellule prima della raccolta. Un ceppo di E. coli privo del gene lacZ può essere utilizzato per applicazioni di biorilevamento ad alta sensibilità e prive di cellule utilizzando una lettura colorimetrica o fluorescente. L'intero protocollo richiede solo 8-9 ore, con solo 1-2 ore di lavoro pratico dall'inoculazione al completamento. Riducendo i costi e i tempi per ottenere lisato senza cellule, questo metodo dovrebbe aumentare l'accessibilità economica dell'espressione genica senza cellule per varie applicazioni.

I risultati rappresentativi possono essere osservati utilizzando l'autolizzato per esprimere GFP da un plasmide che esprime costitutivamente, qui pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, e registrando un corso temporale di fluorescenza GFP in un lettore di piastre (Figura 1B). Una serie di diluizione di DNA plasmidico ha trovato una forte espressione anche a 1 nM di DNA. Rispetto ad un lisato disponibile in commercio, l'autolizzato può produrre una maggiore resa totale e raggiungere un maggiore tas...

Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per produrre lisato batterico per l'espressione genica senza cellule, utilizzando un ceppo ingegnerizzato di Escherichia coli e richiedendo solo attrezzature di laboratorio standard.

Produzione rapida, economica e semplice di lisato privo di cellule batteriche

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Utilizzando questo protocollo, i lisati cellulari batterici di alta qualità possono essere prodotti utilizzando solo apparecchiature di laboratorio comuni ampiamente disponibili, rendendo l'espressione genica senza cellule facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La combinazione dell'autolisi cellulare del programma con un ciclo di congelamento-disgelo o liofilizzazione consente di creare un approccio pratico, laborioso ed economico per una rapida produzione di lisati batterici per l'espressione genica senza cellule. Iniziare utilizzando un ciclo di inoculazione per strisciare le cellule di un ceppo di autolisi di E.coli su piastre di agar LB contenenti 50 microgrammi per millilitro ampicillina, quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, usando una punta di pipetta, prelevare una singola colonia dalla piastra di agar e aggiungerla in un tubo di coltura contenente LB medium con ampicillina. Coltiva questa cultura di avviamento a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere 400 microlitri della coltura di avviamento in un pallone Erlenmeyer da un litro contenente 400 millilitri di mezzo 2xYTPG integrato con 50 microgrammi per millilitro ampicillina.Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con agitazione a 300 RPM. Utilizzando uno spettrofotometro e una cuvetta ottica con una lunghezza del percorso di un centimetro, misurare periodicamente la densità ottica della coltura a 600 nanometri. Quando la densità ottica supera una, iniziare a diluire la coltura cinque volte prima delle misurazioni per garantire che le misurazioni rimangano all'interno dell'intervallo lineare di un tipico spettrofotometro da laboratorio.Una volta che la densità ottica della coltura diluita a cinque volte raggiunge 0,3, rimuovere il matraccio dall'incubatrice e procedere alla preparazione del lisato. Per preparare il lisato, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 1.800 x g per 15 minuti a temperatura ambiente. Versare il surnatante e rimuovere il liquido rimanente usando una pipetta.Aggiungere 45 millilitri di tampone S30A freddo al pellet e risospesciare il pellet mediante vortice. Quindi, pesare un tubo centrifugo vuoto da 50 millilitri prima di trasferire le celle nel tubo. Centrifugare nuovamente le cellule e scartare il surnatante.Aspirare qualsiasi surnatante rimanente usando una pipetta. Pesare nuovamente il tubo e sottrarre il peso del tubo vuoto dal peso visualizzato per ottenere il peso del pellet. Per ogni milligrammo di pellet cellulare, aggiungere due microlitri di tampone S30A freddo integrato con due millimolari ditiotreitolo.Quindi, risospese le cellule con un vigoroso vortice. Quindi, congelare le cellule mettendole in un congelatore negativo a 20 o 80 gradi Celsius negativo fino a quando il pellet non è completamente congelato, quindi scongelare le celle a bagnomaria a temperatura ambiente e vorticare vigorosamente per due o tre minuti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 45 minuti con agitazione a 300 RPM, quindi eliminare il campione di detriti cellulari pesanti centrifugando in tubi centrifughi trasparenti a 30.000 x g per 45 minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire con cura il surnatante in un tubo nuovo con una pipetta, avendo cura di non disturbare il pellet. Se il surnatante trasferito è contaminato da materiale del pellet, ripetere la centrifugazione. Trasferire il surnatante in tubi centrifughi da 1,5 millilitri.E centrifuga ancora una volta a 21.000 x g o alla velocità massima di una centrifuga da tavolo per cinque minuti. Aliquotare l'autolisi eliminata nei volumi desiderati e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Per l'espressione genica senza cellule utilizzando l'autolizzato, mescolare otto microlitri di autolizzato e 8,9 microlitri di premiscela su ghiaccio.Aggiungere DNA a una concentrazione finale di otto nanomoli, qualsiasi altro reagente necessario e acqua per ottenere un volume finale di 20 microlitri. Aggiungere la reazione a una micropiastra a 384 pozzetti e utilizzare un lettore di piastre per misurare il decorso temporale di fluorescenza e gli endpoint. L'espressione GFP utilizzando l'autolizzato con una serie di diluizioni di DNA plasmatico si traduce in una forte espressione anche con un DNA nanomolare.Confrontando l'espressione GFP tra un lisato disponibile in commercio e l'autolizzato, l'autolizzato ha prodotto livelli comparabili di GFP. La variabilità tra lotti di lisato prodotti in due diversi laboratori da diversi ricercatori era di circa due volte. Le tre variabili più critiche sono il rapporto pellet/tampone cellulare, il trasferimento di surnatante privo di detriti e l'utilizzo di una concentrazione ottimale di PEG e magnesio nella reazione finale.Una volta che l'estratto è stato preparato, è possibile utilizzare un ampio arsenale di protocolli esistenti sviluppati per i sistemi di espressione libera da cellule di E.coli, come la degradazione mediata da ClpXP o il quorum sensing mediato da AHL.

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