Un metodo scalabile per studiare la sopravvivenza neuronale in coltura neuronale primaria con risoluzione a singola cellula e in tempo reale

Ángela Rodríguez-Prieto; Ana González-Manteiga; Yaiza Domínguez-Canterla; Carmen Navarro-González; Pietro Fazzari

doi:10.3791/62759

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Articolo metodologico

Un metodo scalabile per studiare la sopravvivenza neuronale in coltura neuronale primaria con risoluzione a singola cellula e in tempo reale

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DOI:

10.3791/62759

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26 luglio 2021

Ángela Rodríguez-Prieto^*¹ , Ana González-Manteiga^*¹ , Yaiza Domínguez-Canterla¹ , Carmen Navarro-González¹ , Pietro Fazzari¹

¹Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo una metodologia semplice, potente e versatile per studiare la sopravvivenza neuronale in seguito a stress citotossico in neuroni corticali primari con risoluzione cellulare in tempo reale o in materiale fisso.

Abstract

La perdita neuronale è al centro di molte neuropatologie, tra cui l'ictus, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson. Diversi metodi sono stati sviluppati per studiare il processo di sopravvivenza neuronale in seguito a stress citotossico. La maggior parte dei metodi si basa su approcci biochimici che non consentono la risoluzione di singole cellule o che comportano metodologie complesse e costose. Qui viene presentato un paradigma sperimentale versatile, economico ed efficace per studiare la sopravvivenza neuronale. Questo metodo sfrutta la marcatura a fluorescenza sparsa dei neuroni seguita dall'imaging dal vivo e dalla quantificazione automatizzata. A questo scopo, i neuroni vengono elettroporati per esprimere marcatori fluorescenti e co-coltivati con neuroni non elettroporati per regolare facilmente la densità cellulare e aumentare la sopravvivenza.

La marcatura sparsa mediante elettroporazione consente una quantificazione automatizzata semplice e robusta. Inoltre, la marcatura fluorescente può essere combinata con la co-espressione di un gene di interesse per studiare specifici percorsi molecolari. Qui, presentiamo un modello di ictus come modello neurotossico, vale a dire, il test di privazione ossigeno-glucosio (OGD), che è stato eseguito in una camera ipossica fatta in casa economica e robusta. Infine, vengono descritti due diversi flussi di lavoro utilizzando IN Cell Analyzer 2200 o l'open-source ImageJ per l'analisi delle immagini per l'elaborazione semiautomatica dei dati. Questo flusso di lavoro può essere facilmente adattato a diversi modelli sperimentali di tossicità e scalato per lo screening ad alto rendimento. In conclusione, il protocollo descritto fornisce un modello in vitro di neurotossicità accessibile, economico ed efficace, che può essere adatto per testare i ruoli di geni e percorsi specifici nell'imaging dal vivo e per lo screening di farmaci ad alto rendimento.

Introduzione

Lo studio dei disturbi neuronali richiede modelli sperimentali suscettibili di analisi genetiche, molecolari e cellulari. I neuroni corticali primari sono un modello molto potente per studiare la sopravvivenza neuronale e la tossicità 1,2,3,4. Nelle condizioni appropriate, i neuroni primari svilupperanno progressivamente contatti sinaptici e presenteranno i segni distintivi dei neuroni maturi. Pertanto, questo modello è più affidabile delle linee cellulari immortalizzate nel modellare la fisiologia dei neuro....