Ottimizzazione della configurazione e delle condizioni per l'elettroretinogramma ex vivo per studiare la funzione della retina in occhi piccoli e grandi

Questo protocollo dimostra le condizioni necessarie per mantenere la funzione retinica nell'ERG ex vivo, in particolare l'onda B estremamente sensibile prodotta dalle cellule bipolari ON. Con l'ERG ex vivo, possiamo misurare la funzione di diversi tipi di neuroni retinici con un elevato rapporto segnale/rumore, consentendo al contempo la facile introduzione di agenti farmacologici. Questo metodo è particolarmente adatto a quantificare l'efficacia degli agenti farmacologici sulla funzione retinica e sulla malattia.

Per iniziare, convertire una configurazione di array multi-elettrodo collegando il supporto del campione ERG ex vivo a un amplificatore differenziale tramite un headstage. L'amplificatore deve essere collegato all'ingresso analogico della scheda di interfaccia del sistema array multi-elettrodo. Utilizzare il software di registrazione per l'array multi-elettrodo per registrare e memorizzare i dati di ingresso dall'ERG ex vivo.

Impostare il guadagno dell'amplificatore differenziale su 100 e aggiungere un'ulteriore amplificazione di tensione 10X, a seconda delle specifiche del digitalizzatore. Impostare il filtro passa-basso su 100 hertz. In alternativa, per convertire una configurazione patch clamp è collegare il portacampioni ERG ex vivo tramite un headstage a un amplificatore differenziale, che deve essere collegato all'headstage dell'amplificatore patch clamp .

Utilizzare il software del sistema patch clamp e il digitalizzatore per registrare e memorizzare i dati di input dall'ERG ex vivo. Impostare i parametri come mostrato in precedenza. Collegare i LED con le lunghezze d'onda appropriate al microscopio.

Per controllare gli stimoli luminosi, utilizzare un driver LED controllato da uscite analogiche da un digitalizzatore. Controlla i LED con un software di registrazione che consentirà l'attivazione di stimoli luminosi. Quindi, calibrare l'emissione luminosa dei LED nella posizione della retina nel supporto del campione utilizzando un fotodiodo.

Se necessario, inserire filtri a densità neutra per attenuare l'intensità della luce nel percorso della luce. Per preparare l'elettrodo, inserire un elettrodo per pellet di cloruro d'argento in un connettore filettato per esca. Riempire l'interno del connettore esca con colla a caldo e inserire una presa di due millimetri nella colla a caldo dal lato non filettato.

Saldare un filo d'argento dell'elettrodo EP-1 alla presa da due millimetri. Avvitare l'elettrodo finito con un O-ring sulla filettatura nelle porte dell'elettrodo del portacampioni ERG ex vivo. Per gli occhi grandi, compresi gli occhi dei donatori umani, pulire il globo del tessuto connettivo rimanente e rimuovere il segmento anteriore e la lente.

Usa un bisturi per fare un taglio a circa tre millimetri dal limbus. Inserire forbici da dissezione curve nell'incisione e tagliare lungo il limbus per rimuovere la porzione anteriore dell'occhio con la lente. Ottenere campioni retinici per l'elettroretinografia ex vivo con un punch bioptico monouso da tre a sei millimetri.

Per montare il tessuto sul supporto del campione, posizionare la metà inferiore del supporto del campione in una grande capsula di Petri e riempirla con mezzo di Ames ossigenato in modo che la cupola del supporto del campione sia appena sommersa. Afferrare con attenzione il bordo della retina con una pinza fine e trasferire la retina sulla cupola del portacampioni ex vivo, lato fotorecettore rivolto verso l'alto. Sollevare il supporto del campione dalla soluzione di Ames, avendo cura che la retina rimanga in posizione.

Asciugare completamente la piastra del portacampioni per ridurre al minimo il rumore, la diafonia elettrica e lo smistamento del segnale. Quindi assemblare entrambe le metà del supporto del campione con quattro viti e collegare la linea di perfusione. Guidare l'elettrodo nella metà inferiore del supporto del campione e collegare il cavo anodico al lato retinico interno e il cavo catodico al lato fotorecettore.

Permeare il supporto del campione con almeno un millilitro al minuto di mezzo di Ames ossigenato per 10-20 minuti per consentire la stabilizzazione delle risposte alla luce. L'ERG ex vivo ha permesso la registrazione delle risposte alla luce dei fotorecettori e delle cellule bipolari ON dalla retina del topo. La registrazione delle risposte dei fotorecettori dalle retine dei donatori umani è stata possibile con un ritardo postmortem fino a cinque ore dell'enucleazione e meno di 20 minuti di ritardo per le risposte delle cellule bipolari ON.

In condizioni ideali, le ampiezze di risposta e la cinetica in entrambi i tipi di cellule erano relativamente stabili nel tempo, ma hanno mostrato un lento declino da 40 a 45 minuti dopo che le retine sono state montate sul supporto del campione. La temperatura ridotta nel supporto del campione ha notevolmente rallentato la cinetica sia dei fotorecettori che delle cellule bipolari ON. Tuttavia, ha diminuito l'ampiezza dell'onda B ma non dell'onda A.

Al contrario, il rallentamento della velocità di perfusione ha ridotto le ampiezze sia del fotorecettore che delle risposte delle cellule bipolari ON, ma non ha influenzato il tempo implicito dell'onda A o dell'onda B. La cessazione della perfusione per 10 minuti seguita da riperfusione ha provocato una perdita completa della funzione delle cellule bipolari ON con risposte fotorecettoriali preservate. Una velocità di perfusione e una temperatura fisiologica sufficienti sono fondamentali per ottenere risposte stabili, in particolare, dalle cellule bipolari ON nell'ERG ex vivo.

Questo protocollo consente l'esplorazione approfondita delle differenze nella funzione dei fotorecettori nella maculare e nella periferia umana, rispondendo a domande che in precedenza potevano essere svolte solo nei primati non umani.