Name: Modifica chimica del residuo di triptofano in un dominio N Ricombinante Ca2+-ATPasi per lo studio del triptofano-ANS FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Scopri la modifica chimica del triptofano nel dominio N della Ca²⁺-ATPasi per studiare il trasferimento di energia FRET con ANS. Questo metodo biochimico chiarisce il ruolo dei residui di triptofano nelle interazioni proteiche.

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Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal numero di sovvenzione FAI-UASLP C19-FAI-05-89.89 e dal numero di sovvenzione CONACYT 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Gli autori ringraziano l'assistenza tecnica di Julian E. Mata-Morales in edizione video.

1. Determinazione (in silico) dell'interazione ANS e SERCA N-dominio
<ol><li>Generare una struttura tridimensionale (3D) della proteina (SERCA N-domain) mediante modellazione molecolare utilizzando il software di modellazione proteica preferito50.</li>
	<li>Identificare i residui di amminoacidi che formano il sito di legame nucleotidico utilizzando il software di struttura molecolarepreferito 51e determinare la presenza di residui di Arg e Lys35; questi sono necessari per il legame ANS e per aumentare l'intensità di fluorescenza (resa quantistica).</li>
	<li>Eseguire l'attracco molecolare (utilizzando il software di docking preferito)52,53,54 per determinare le interazioni di ATP, isotiocianato di fluoresceina (FITC) (che forma un legame covalente con Lys515 che etichetta il sito di legame nucleotidico) e ANS con residui di amminoacidi nel sito di legame nucleotidico ( Figura1).</li>
	<li>Calcolare la distanza molecolare (Å) tra il residuo Trp e l'ANS legato utilizzando lo strumento di misurazione nel software preferito.</li>
	<li>Eseguire simulazioni di dinamica molecolare del complesso ANS-N-dominio per determinare la stabilità dell'interazione52,54. Quindi, eseguire gli esperimenti in vitro quando la stabilità del complesso è stata confermata.</li>
</ol>2. Espressione e purificazione del dominio N ricombinante
<ol><li>Sintetizzare il gene che codifica per il dominio N40.</li>
	<li>Progettare e costruire il plasmide che contiene il gene sintetico che codifica per il dominio N40.</li>
	<li>Esprimere e purificare mediante cromatografia di affinità (Ni-NTA), il dominio N ricombinante ingegnerizzato. Eseguire una SDS-PAGE della proteina purificata per determinarne la purezza (Figura 2)40.</li>
	<li>Determinare la concentrazione proteica studiando l'assorbanza a λ di 280 nm con il coefficiente di estinzione del dominio N (ε= 11.960 M-1·cm-1)40.</li>
</ol>3. Monitorare la formazione del complesso ANS-N-dominio in base alle variazioni di intensità di fluorescenza ANS e N-dominio.
<ol><li>Preparare una soluzione stock ANS in N,N-dimetilformammide.<ol>
<li>Pesare una piccola quantità (1-5 mg) di ANS e scioglierla in 1 mL del volume finale di N,N-dimetilformammide, ad esempio 3,2 mg (concentrazione finale di 10,69 mM).</li>
		<li>Preparare una soluzione stock acquosa ANS da 100 μM utilizzando la soluzione ANS in N,N-dimetilformammide, ad esempio, aggiungere 9,4 μL della soluzione ANS da 10,69 mM a 990,6 μL di tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0 per ottenere un volume finale di 1 mL.</li>
		<li>Mescolare le soluzioni vorticosamente 3 - 5 volte per 15 s. NOTA: nell'esperimento seguente, utilizzare solo la soluzione stock acquosa ANS. Preparare al fresco la soluzione stock acquosa ANS prima di iniziare gli esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione stock NBS in N,N-dimetilformammide.<ol>
<li>Pesare una piccola quantità (1-5 mg) di NBS e scioglierla in 1 mL di N,N-dimetilformammide, ad esempio 5,3 mg in 1 mL (29,78 mM di concentrazione finale).</li>
		<li>Preparare una soluzione stock acquosa NBS da 1 mM utilizzando la soluzione NBS in N,N-dimetilformammide, ad esempio, aggiungere 3,36 μL della soluzione NBS da 29,78 mM a 96,64 μL di tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0 per ottenere un volume finale di 0,1 mL.</li>
		<li>Mescolare le soluzioni vorticosamente 3 - 5 volte per 15 s. NOTA: Preparare nuovamente la soluzione stock acquosa NBS prima di iniziare gli esperimenti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Titolare il dominio N con ANS e registrare gli spettri di fluorescenza per eccitazione a λ=295 nm a 25 °C.<ol>
<li>Ottenere la linea di base dello spettro di fluorescenza.<ol>
<li>Posizionare 1 mL di tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0 in una cuvetta di quarzo a fluorescenza da 1 mL.</li>
			<li>Posizionare la cella nella camera cellulare termo-dichiarata (25 °C) dello spettrofluorometro e impostare l'eccitazione λ su 295 nm.</li>
			<li>Registrare lo spettro di fluorescenza (305 - 550 nm). NOTA: Lo spettro di fluorescenza del tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0, che funge da campione in bianco, viene sottratto da tutti gli spettri di fluorescenza ottenuti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ottenere lo spettro di fluorescenza intrinseco del dominio N.<ol>
<li>Posizionare 900 μL di tampone fosfato da 50 mM con pH 8,0 in una cuvetta di quarzo a fluorescenza.</li>
			<li>Aggiungere 100 μL di sospensione di N-dominio (10 μM) per ottenere una concentrazione finale di 1 μM N-dominio in un volume finale di 1 mL.</li>
			<li>Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta 20 volte per garantire l'omogeneità della soluzione. NOTA: La proteina deve essere purificata di fresco per ottenere spettri di fluorescenza intrinseca di alta qualità, ad esempio, il dominio N ricombinante purificato può essere utilizzato solo per una settimana dopo la purificazione.</li>
			<li>Posizionare la cella nella camera cellulare termo-dichiarata (25 °C) dello spettrofluorometro e impostare l'eccitazione λ su 295 nm.</li>
			<li>Registrare lo spettro di fluorescenza intrinseca del dominio N (305-550 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere ANS e ottenere lo spettro di fluorescenza per eccitazione a λ=295 nm.<ol>
<li>Aggiungere un'aliquota di 2 μL di soluzione acquosa acquosa di 100 μM al dominio N sospeso (1 μM) per ottenere una concentrazione finale di ANS di 0,2 μM.</li>
			<li>Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta 20 volte per garantire l'omogeneità della soluzione.</li>
			<li>Posizionare la cella nella camera cellulare termostudente (25 °C) dello spettrofluorometro e impostare l'eccitazione λ su 295 nm.</li>
			<li>Registrare lo spettro di fluorescenza (305-550 nm).</li>
			<li>Ripetere le aggiunte ANS e gli spettri di fluorescenza registrando sopra la relazione molare 1:1 ANS:N-dominio.</li>
			<li>Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando un software adatto.</li>
			<li>Traccia tutti gli spettri in un unico grafico.</li>
			<li>Determinare se gli spettri formano un modello simile a FRET. Gli spettri di fluorescenza del dominio ANS-N formano un modello simile a FRET (Figura 3A).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Titolazione a fluorescenza intrinseca N-dominio mediante modificazione chimica Trp con NBS.
<ol><li>Ripetere i passaggi 3.3.1 e 3.3.2.</li>
	<li>Aggiungere un'aliquota di 1 μL di 1 mM NBS soluzione acquosa allo S-dominio N sospeso (1 μM) per ottenere una concentrazione finale di 1 μM NBS.</li>
	<li>Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta 20 volte per garantire l'omogeneità della soluzione.</li>
	<li>Posizionare la cella nella camera cellulare termostudente (25 °C) dello spettrofluorometro e impostare l'eccitazione λ su 295 nm.</li>
	<li>Registrare lo spettro di fluorescenza (305-550 nm) (Figura 3B).</li>
	<li>Ripetere l'addizione NBS e la registrazione degli spettri di fluorescenza fino a quando non si osserva una minima tempra intrinseca di fluorescenza del dominio N40. Nel dominio N, questo di solito si verifica ad un rapporto molare di 5-6 NBS / N-dominio40. NOTA: NBS spegne rapidamente (<5 s) la fluorescenza intrinseca del dominio N; si osserva una diminuzione dell'intensità di fluorescenza. Procedere immediatamente al passaggio successivo, poiché NBS può anche reagire con altri residui di amminoacidi47.</li>
	<li>Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando un software adatto.</li>
	<li>Tracciare tutti gli spettri in un unico grafico (Figura 3B).</li>
</ol>5. Titolare il dominio N modificato da NBS con ANS registrando spettri di fluorescenza a 25 °C.
<ol><li>Eseguire il passaggio 3.3.3 utilizzando il dominio N modificato NBS generato nel passaggio 4.</li>
	<li>Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando un software adatto.</li>
	<li>Tracciare tutti gli spettri in un unico grafico (Figura 3C).</li>
	<li>Gli spettri di fluorescenza generati (Figura 3C) supportano o confutano il verificarsi di FRET, cioè quando si verifica FRET, la fluorescenza ANS non aumenta e viceversa.</li>
</ol>6. Evidenza del legame di ANS al dominio N chimicamente modificato mediante eccitazione a λ=370 nm.
<ol><li>Eseguire il passaggio 3.3.3 utilizzando il dominio N modificato NBS generato nel passaggio 4, ma modificando l'eccitazione λ in 370 nm.</li>
	<li>Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando un software adatto.</li>
	<li>Tracciare tutti gli spettri in un unico grafico (Figura 3D).</li>
	<li>Confermare il legame ANS al dominio N osservando l'aumento dell'intensità di fluorescenza ANS. Il legame ANS al dominio N mostra un aumento della fluorescenza quando eccitato a λ=370 nm (Figura 3D). Come controllo, lo spettro di fluorescenza di ANS (da solo) in tampone fosfato 50 mM con pH 8,0 è stato ottenuto eccitante a λ di 295 e 370 nm (Figura 4, non mostrato in video). NOTA: La relazione stechiometrica di NBS:Trp necessaria per la modifica chimica dipende dal grado di interramento dei residui di Trp nella proteina in studio46,47,55,56. Pertanto, si raccomanda di determinare in anticipo il rapporto molare NBS:proteina/(Trp).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Gli spettri di fluorescenza del complesso ANS-N-domain mostrano un pattern simile a FRET quando eccitati ad un λ di 295 nm, mentre la distanza molecolare (20 Å) tra il residuo Trp e ANS sembra supportare l'insorgenza di FRET (Figura 1). La modifica chimica Trp da parte di NBS si traduce in un dominio N meno fluorescente (Figura 3B, Spettro f); quindi, il trasferimento di energia non è possibile. Gli spettri di fluorescenza ANS sono simili a quelli del dominio N ...

Il trasferimento di energia di risonanza di Föster (FRET) è diventato una tecnica standard per determinare la distanza tra le strutture molecolari dopo il legame o l'interazione negli studi di struttura e funzione delle proteine1,2,3,4. Nelle ATPasi di tipo P, FRET è stato utilizzato per studiare la struttura e la funzione del reticolo sarco-endoplasmatico Ca2+-ATPasi (SERCA)2,5,6,7,8, ad esempio, le fluttuazioni strutturali durante il ciclo catalitico sono state analizzate nell'intera proteina da FRET7.
I donatori di FRET sono diversi e vanno da piccole molecole fluorescenti (estrinseche) a proteine fluorescenti9,10. I residui di triptofano (Trp) (dovuti alla loro fluorescenza) sono utili per identificare i cambiamenti strutturali nelle sequenze di aminoacidi proteici11,12. L'intensità di fluorescenza del Trp dipende sostanzialmente dalla polarità dell'ambientecircostante13,14. Il legame del ligando di solito genera riarrangiamenti strutturali inproteine/enzimi 15,16. Se Trp è presente o situato vicino al sito di legame proteico, le fluttuazioni strutturali influenzano frequentemente il grado di esposizione di Trp ai mezzi acquosi13,14; quindi, il cambiamento di polarità provoca l'tempra dell'intensità di fluorescenza Trp13,14. Quindi, la proprietà fluorescente di Trp è utile per eseguire studi di legame del ligando per gli enzimi. Altri fenomeni fisici possono anche portare alla tempra di fluorescenza Trp17,18,19,20, ad esempio, FRET e cambiamenti nella polarità media. Il trasferimento di energia dallo stato eccitato di Trp a un fluoroforo ha anche potenziali applicazioni, ad esempio la determinazione dell'affinità di piccoli ligandi nelle proteine21. Infatti, Trp è stato utilizzato principalmente come donatore di fluorescenza negli studi FRET nelle proteine22,23,24, ad esempio, negli studi FRET sul terbio (Tb3 +),un residuo Trp viene utilizzato frequentemente come antenna per il trasferimento di energia a Tb3 +25,26,27. Trp mostra vari vantaggi rispetto ad altri donatori di FRET a causa del suo carattere costitutivo intrinseco nella struttura proteica, che elimina la necessità di processi preparativi che possono influenzare la funzione / struttura della proteina24studiata. Pertanto, l'identificazione dei decadimenti radiativi (trasferimento di energia e cambiamenti nella polarità media indotti da riarrangiamenti strutturali proteici) è importante per trarre conclusioni accurate sul legame del ligando negli studi strutturali sulle proteine13,14,19,28.
Negli studi strutturali sulle proteine, un fluoroforo estrinseco, vale a dire 8-anilino-1-naftalene solfonato (ANS), è stato utilizzato principalmente in esperimenti relativi al ripiegamento / dispiegamento delle proteine28,29. ANS si lega a proteine/enzimi allo stato nativo, solitamente nei siti di legame dei substrati31,32,33; un aumento della resa quantistica di fluorescenza ANS (ΦF) (vale a dire, un aumento dell'intensità di fluorescenza) è indotto dall'eccitante proteina a λ = 370 nm quando si verificano interazioni adeguate di ANS con Arg e i suoi residui in tasche idrofobiche34,35,36,37. In vari studi, è stata segnalata la presenza di FRET (quando eccitante a λ entro 280-295 nm) tra residui di Trp (donatori) e ANS (accettore), che si basa su quanto segue: 1) sovrapposizione dello spettro di emissione di fluorescenza di Trp e spettro di eccitazione di ANS, 2) identificazione di una distanza adeguata tra uno o più residui di Trp e ANS per il trasferimento di energia, 3) elevata resa quantistica ANS quando legata in sacche proteiche, e 4) pattern FRET caratteristico negli spettri di fluorescenza della proteina in presenza di ANS3,17,27,37,38.
Recentemente, il legame del ligando al dominio di legame nucleotidico (dominio N) in SERCA e altre ATPasi di tipo P sono stati studiati utilizzando N-domini N ricombinanti ingegnerizzati40,41,42,43,44,45,46. L'ingegneria molecolare del dominio N SERCA è stata utilizzata per spostare l'unico residuo Trp (Trp552Leu) in una struttura più dinamica (Tyr587Trp) che è vicina al sito di legame nucleotidico, dove le variazioni di fluorescenza (tempra) possono essere utilizzate per monitorare i cambiamenti strutturali sul legame del ligando34. I risultati sperimentali hanno dimostrato che ANS si lega (come ATP) al sito di legame nucleotidico nel ricombinante purificato SERCA N-domain34. È interessante notare che la fluorescenza ANS aumenta quando si lega al dominio N all'eccitazione a un λ di 295 nm, mentre la fluorescenza intrinseca del dominio N diminuiscedi 34, producendo così un modello FRET che suggerisce la formazione di una coppia Trp-ANS FRET.
L'uso di NBS è stato proposto per determinare il contenuto di residui di Trp nelle proteine47 mediante il saggio di assorbanza di proteine modificate. NBS modifica il gruppo indolo altamente assorbente di Trp al meno assorbenteossindolo 47,48. Ciò si traduce nella perdita (spegnimento) della proprietà fluorescente Trp40. Quindi, la modifica chimica mediata da NBS dei residui di Trp può essere utilizzata come saggio per definire il ruolo di Trp (come donatore) quando si ipotizza FRET.
Questo protocollo descrive la modifica chimica dell'unico residuo di Trp da parte di NBS nel dominio N ricombinante ingegnerizzato di SERCA come modello proteico. I risultati sperimentali dimostrano che l'intensità di fluorescenza ANS aumenta ancora nel dominio N34modificato chimicamente NBS, che manca di fluorescenza intrinseca. Pertanto, il saggio è utile per dimostrare l'assenza di FRET tra il residuo Trp e ANS quando legato al dominio N34,40,49. Quindi, questo test (modifica chimica NBS di Trp) è utile per dimostrare la presenza della coppia Trp-ANS FRET nelle proteine.

<table><tbody><tr><td>Acrilammide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610107</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>8-Anilino-1-acido naftalensolfonico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1028</td><td>Fluoroforo</td></tr><tr><td>Bis-acrilammide</td><td>Bio-Rad</td><td>1610125</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>N-Bromosuccinimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B81255</td><td>Chimico modifica</td></tr><tr><td>N,N-dimetilformammide</td><td>J.T. Baker</td><td>9213-12</td><td>Preparazione della soluzione madre</td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Etichetta di fluorescenza chimica</td></tr><tr><td>Cuvetta di fluorescenza</td><td>Hellma</td><td>Z801291</td><td>Saggio di fluorescenza</td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro di fluorescenza</td><td>Shimadzu</td><td>RF 5301PC</td><td>Saggio</td></tr> <tr>di fluorescenza<td>La sua trappola e il commercio; FF</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0004-59</td><td>Purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>IPTG, senza diossano</td><td>Bionalytical americano</td><td>AB00841-00010</td><td>Espressione proteica</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td>Purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000713</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Pipetman L P10L</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td>Fluorescenza test</td></tr><tr><td>Pipetman L P100L</td><td>Gilson</td><td>FA10004M</td><td>Saggio di fluorescenza</td></tr><tr><td>Pipetman L P200L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>Saggio di fluorescenza</td></tr><tr><td>Pipetman L P1000L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Saggio di fluorescenza</td></tr><tr><td>Pipetman L P5000L</td><td>Gilson</td><td>FA10007</td><td>Saggio di fluorescenza</td></tr><tr><td>Precision plus std</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>J.T. Baker</td><td>3828-19</td><td>Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-01</td><td>Preparazione del tampone</td></tr><tr><td>Filtro per siringa 0,2 um</td><td>Millipore</td><td>GVWP04700</td><td>Filtrazione della soluzione</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>PAGINA SDS</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

modifica chimica del residuo di triptofano in un dominio n ricombinante ca2+-atpasi per lo studio del triptofano-ans fret

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

Il reticolo sarco/endoplasmatico Ca2+-ATPasi (SERCA) è un'ATPasi di tipo P che è stata cristallizzata in varie conformazioni. Informazioni funzionali dettagliate possono tuttavia essere ottenute da domini ricombinanti isolati. Il dominio di legame nucleotidico ricombinante (Trp552Leu e Tyr587Trp) ingegnerizzato (dominio N) mostra una tempra di fluorescenza al legame del ligando. Un fluoroforo estrinseco, vale a dire 8-anilino-1-naftalene solfonato (ANS), si lega al sito di legame nucleotidico tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche con residui di Arg, His, Ala, Leu e Phe. Il legame ANS è evidenziato dall'aumento dell'intensità di fluorescenza quando eccitato ad una lunghezza d'onda (λ) di 370 nm. Tuttavia, quando eccitato a λ di 295 nm, l'aumento dell'intensità della fluorescenza sembra essere accoppiato alla tempra della fluorescenza intrinseca del dominio N. Gli spettri di fluorescenza mostrano un modello simile al trasferimento di energia di risonanza di Föster (FRET), suggerendo così la presenza di una coppia Trp-ANS FRET, che sembra essere supportata dalla breve distanza (~ 20 Å) tra Tyr587Trp e ANS. Questo studio descrive un'analisi della coppia Trp-ANS FRET mediante modificazione chimica Trp (e tempra a fluorescenza) mediata da N-bromosuccinimide (NBS). Nel dominio N chimicamente modificato, la fluorescenza ANS aumentava quando eccitata a λ di 295 nm, simile a quando eccitata a λ di 370 nm. Quindi, la modifica chimica mediata da NBS del residuo Trp può essere utilizzata per sondare l'assenza di FRET tra Trp e ANS. In assenza di fluorescenza Trp, non si dovrebbe osservare un aumento della fluorescenza ANS. La modifica chimica dei residui di Trp nelle proteine da parte di NBS può essere utile per esaminare FRET tra residui di Trp che sono vicini all'ANS legato. Questo test sarà probabilmente utile anche quando si utilizzano altri fluorofori.

L'attracco molecolare mostra il legame di ANS al sito di legame nucleotidico del dominio N tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche (Figura 1). La distanza molecolare (20 Å) tra il residuo di Trp e ANS (legato al sito di legame nucleotidico) supporta la presenza di FRET (Figura 1). Il dominio N ricombinante progettato (ingegnerizzato) è stato ottenuto ad alta purezza mediante cromatografia ad affinità (Figura 2) ed era adat...

ANS si lega al dominio N ricombinante Ca2+-ATPasi. Gli spettri di fluorescenza mostrano un modello simile a FRET all'eccitazione ad una lunghezza d'onda di 295 nm. La modifica chimica mediata da NBS di Trp spegne la fluorescenza del dominio N, che porta all'assenza di trasferimento di energia (FRET) tra il residuo Trp e ANS.

Modifica chimica del residuo di triptofano in un dominio N Ricombinante Ca2+-ATPasi per lo studio del triptofano-ANS FRET

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

Questi saggi possono aiutare a chiarire il ruolo dei residui di triptofano nelle proteine durante l'esecuzione di studi di legame ANS. La fluorescenza ANS aumenta quando si lega a specifici siti strutturali nelle proteine. A volte il sito di legame ANS si trova vicino a un residuo di triptofano con una distanza che suggerisce l'esistenza di FRET tra il triptofano e l'ANS.NBS media la modifica chimica dei residui di triptofano nelle proteine, estinguendone la fluorescenza. Pertanto, questi saggi consentono di determinare se i residui di triptofano contribuiscono all'aumento dell'intensità di fluorescenza ANS da parte di FRET. In questo lavoro, utilizziamo un dominio di legame nucleotidico ricombinante ingegnerizzato da SERCA contenente mutazioni, con l'obiettivo di localizzare un triptofano vicino al sito di legame nucleotidico in cui si lega anche ANS.Questo test è rapido e facile da eseguire, da qui il suo principale vantaggio. Determinazione in silico dell'interazione ANS e SERCA N-Domain. Generare una struttura tridimensionale della proteina mediante modellazione molecolare utilizzando il software di modellazione proteica preferito.Identificare i residui di amminoacidi che formano il sito di legame nucleotidico utilizzando il software strutturale molecolare preferito e determinare la presenza di residui di arginina e lisina. Questi sono necessari per il legame ANS e aumentano l'intensità della fluorescenza. A causa della presenza di residui di arginina e lisina nel sito di legame nucleotidico di SERCA, ipotizziamo il legame di ANS al dominio N.Nel modello 3D, i residui di amminoacidi che formano il sito di legame dell'ATP sono identificati ed evidenziati in arancione. Allo stesso modo, la mutazione tirosina-triptofano si trova ed evidenziata in blu. Eseguire l'attracco molecolare con ATP, FITC e ANS.I risultati dell'attracco mostrano che ANS si adatta bene al sito di legame nucleotidico, in modo simile ad ATP e FITC. FITC etichetta il sito di legame nucleotidico. Calcolare la distanza molecolare tra il residuo di triptofano e ANS.20 angstrom sembra essere una distanza adeguata per FRET. Eseguire la simulazione dinamica molecolare del complesso ANS N-Domain per determinare la stabilità dell'interazione. Un tempo di simulazione di 10 nanosecondi mostra la stabilità del complesso.Procedere all'esecuzione degli esperimenti in vitro. Espressione e purificazione del dominio N ricombinante. Esprimere e purificare, per cromatografia di affinità, il dominio N ricombinante ingegnerizzato.Eseguire una SDS-PAGE della proteina purificata per determinarne la purezza. Determinare la concentrazione proteica per assorbanza a una lunghezza d'onda di 280 nanometri con il coefficiente di estinzione del dominio N. Monitorare la formazione del complesso ANS N-Domain in base alle variazioni di intensità di fluorescenza ANS e N-Domain.Preparare una soluzione stock ANS in N, N-dimetilformammide. Pesare una piccola quantità di ANS, tra uno e cinque milligrammi. Sciogliere ANS in un mL di volume finale di N, N-dimetilformammide.Preparare una soluzione stock ANS da 100 micromolari utilizzando la soluzione ANS in N, N-dimetilformammide. Mescolare la soluzione vorticosamente da tre a cinque volte. Preparare la soluzione stock NBS in N, N-dimetilformammide.Pesare una piccola quantità di NBS, da uno a cinque milligrammi. Sciogliere l'NBS in un mL di N, N-dimetilformammide. Preparare una soluzione stock NBS mono millimolare utilizzando la soluzione NBS in N, N-dimetilformammide.Mescolare la soluzione vorticosamente da tre a cinque volte. Titolare il dominio N con ANS e registrare gli spettri di fluorescenza per l'eccitazione ad una lunghezza d'onda di 295 nanometri a 25 gradi. Ottenere la linea di base dello spettro di fluorescenza.Posizionare un mL di tampone fosfato 50 millimolare con pH otto in una cuvetta di quarzo a fluorescenza da un mL. Posizionare la cella nella camera cellulare termostatata dello spettrofotometro e impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 295 nanometri. Registrare lo spettro di fluorescenza.Lo spettro di fluorescenza del bianco mostra il picco dell'acqua, che deve essere sottratto in seguito. Ottenere lo spettro di fluorescenza intrinseco del dominio N. Posizionare 900 microlitri di tampone fosfato millimolare con pH 8 in una cuvetta di quarzo a fluorescenza.Aggiungere 100 microlitri di sospensione N-Domain per ottenere una concentrazione finale di N-Domain micromolare. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità della soluzione. Posizionare la cella nella camera termostatata dello spettrofotometro.Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 295 nanometri. Registrare lo spettro di fluorescenza intrinseca N-Domain. Aggiungi ANS e ottieni lo spettro di fluorescenza per eccitazione ad una lunghezza d'onda di 295 nanometri.Aggiungere un'aliquota di due microlitri di 100 micromolari ANS soluzione stock al dominio N sospeso per ottenere una concentrazione finale di ANS micromolare di 0,2 micromolari. Omogeneizzare delicatamente, utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità di questa soluzione. Registrare lo spettro di fluorescenza.Ripetere le aggiunte ANS e la registrazione spettrale di fluorescenza come descritto sopra per una relazione molare N-Dominio ANS 1:1. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando il software. Traccia tutti gli spettri in un singolo grafico Determina se un modello simile a FRET è formato dallo spettro.Gli spettri di fluorescenza ANS N-Domain formano un modello simile a FRET. Titolazione della florescenza intrinseca N-Domain mediante modifica chimica del triptofano con NBS. Ottenere nuovamente lo spettro di fluorescenza intrinseco del dominio N.Aggiungere un'aliquota di un microlitro di una soluzione stock NBS millimolare al dominio N sospeso per ottenere una concentrazione finale di un NBS micromolare. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità della soluzione. Registrare lo spettro di fluorescenza.Ripetere l'addizione NBS e la registrazione spettrale a fluorescenza fino a quando non si osserva una minima tempra intrinseca a fluorescenza N-Domain. Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità della soluzione. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando il software.Traccia tutti gli spettri in un unico grafico. Titolare il dominio N modificato NBS con ANS registrando spettri di fluorescenza a 25 gradi. Aggiungi ANS e ottieni lo spettro di fluorescenza per eccitazione ad una lunghezza d'onda di 295 nanometri.Omogeneizzare delicatamente utilizzando una micropipetta per garantire l'omogeneità della soluzione. Registrare lo spettro di fluorescenza. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando il software.Traccia tutti gli spettri in un unico grafico. Gli spettri di fluorescenza generati supportano o confutano il verificarsi di FRET. Vale a dire quando si verifica FRET, la fluorescenza ANS non aumenta e viceversa.Evidenza di legame di ANS al dominio N chimicamente modificato mediante eccitazione a una lunghezza d'onda di 370 nanometri. Aggiungi ANS al dominio N modificato NBS e registra lo spettro di fluorescenza intrinseca del dominio N per eccitazione a una lunghezza d'onda di 370 nanometri. Sottrarre lo spettro vuoto da ogni spettro utilizzando il software.Traccia tutti gli spettri in un unico grafico. Confermare il legame ANS al dominio N aumentando l'intensità di fluorescenza ANS. Il legame ANS al dominio N mostra un aumento della fluorescenza quando eccitato a una lunghezza d'onda di 370 nanometri.Panoramica dei risultati. Il complesso Panel A.ANS N-Domain visualizza un modello simile a FRET quando è eccitante a una lunghezza d'onda di 295 nanometri. Il pannello B.NBS spegne la fluorescenza intrinseca del dominio N modificando chimicamente l'unico residuo di triptofano nel dominio N chimicamente modificato.Pannello C.La fluorescenza ANS aumenta quando viene eccitante a una lunghezza d'onda di 295 nanometri. Pannello D.La fluorescenza ANS aumenta anche quando si emoziona a una lunghezza d'onda di 370 nanometri. Pertanto, l'eccitazione diretta di ANS a una lunghezza d'onda di 295 nanometri è la principale fonte di fluorescenza ANS quando è legata al sito di legame ATP. Conclusioni.Questi saggi possono essere utilizzati per determinare l'esistenza di FRET tra residui di triptofano e ANS nelle proteine. Il chiarimento del FRET, conferma o meno, tra triptofano e ANS permetterà di trarre conclusioni migliori negli studi strutturali sulle proteine. Il test può anche essere utile quando si utilizzano altri fluorofori.

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