Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila

Il test dell'alimentatore a micropiasche fornisce un metodo semplice, ad alto rendimento ed economico per misurare il comportamento di alimentazione della Drosophila e offre molteplici vantaggi rispetto ad altri metodi più elaborati. Quantificare il consumo misurando l'assorbanza con un lettore di piastre elimina le misurazioni manuali e ovvia all'immissione manuale dei dati. I dati sono anche suscettibili di estrazione ed elaborazione programmatica.

Con questo test ad alto rendimento possiamo quantificare il consumo di nutrienti idrosolubili, farmaci, prodotti farmaceutici o tossine e il sistema può essere modificato per applicazioni a una varietà di specie di insetti. Iniziare versando l'agarosio fuso in una depressione di reagente ed erogare 80 microlitri di agarosio fuso in ciascun pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetto usando una pipetta multicanale. Conservare in frigorifero l'agarose avanzato per un massimo di una settimana in un sacchetto sigillato e riforlo per creare piastre aggiuntive.

Se le strisce di barriera sono troppo larghi, arrotolarle attorno al dito per dare loro la curvatura per tenerle nei canali. Inserire le strisce barriera nei canali della striscia barriera per preparare gli accoppiatori. Fissare l'accoppiatore a una piastra di fame, assicurandosi di non utilizzare l'accoppiatore per manipolare la piastra in quanto l'accoppiatore potrebbe scivolare via.

Assicurarsi che l'angolo angolato dell'accoppiatore corrisponda all'angolo angolato della micropiastra per mantenere l'orientamento corretto. Sotto anestesia CO2, ordinare mosche da tre a cinque giorni. Carica le singole mosche per colonna nella piastra di fame.

Chiudi ogni colonna mentre si riempie regolando la sua striscia barriera in posizione chiusa. Registrare con attenzione il layout del campione all'interno della micropiastra. Una volta riempita la piastra di fame, lasciare che le mosche si riprendano spontaneamente dopo aver rimosso la CO2 e farle morire di fame per sei ore a partire dal loro tempo di anestesia iniziale.

Preparare 10 millilitri di cibo liquido in un tubo conico da 15 millilitri sciogliendo 0,4 grammi di saccarosio e 0,1 grammi di estratto di lievito in 10 millilitri di acqua distillata. Vortice il tubo fino a quando i solidi si dissolvono completamente. Aggiungere 40 microlitri di soluzione stock di colorante e trasferire il cibo liquido in una siringa da 10 millilitri con punta con un filtro da 0,45 micrometri.

Filtrare circa 1,5 millilitri della soluzione alla volta in un tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri. Mettere da parte la siringa contenente la soluzione e filtrare la soluzione aggiuntiva secondo necessità durante la preparazione della piastra di alimentazione. Preparare una piastra di alimentazione sigillando il fondo di una micropiastra a 1536 pozzetti con un film sigillante.

Utilizzare una paletta di tenuta per aderire completamente al film. Quindi, tagliare la pellicola in eccesso dai bordi sinistro e destro con una lama di rasoio. Erogare 10 microlitri del cibo liquido filtrato a colonna nel pozzo in alto a sinistra per ogni gruppo di quattro pozzi della micropiastra da 1536 pozzi.

Una volta riempiti tutti i pozzetti, applicare un film sigillante sulla parte superiore della piastra, seguendo gli stessi passaggi utilizzati per sigillare il fondo della micropiastra. Ripetere per il numero desiderato di piastre. Centrifugare le piastre a 200 volte G per 10 secondi per depositare il fluido.

Non lasciare raffreddare la piastra poiché ciò può causare l'accumulo di condensa nei pozzetti, oscurando le letture di assorbanza. Perforare i pozzetti sulla superficie superiore della piastra con lo strumento sonda ad ago dotato di un ago da 0,25 millimetri di diametro, utilizzando lo stesso ordine di perforazione utilizzato durante l'erogazione delle soluzioni. Pulire l'ago tra le soluzioni per evitare la contaminazione incrociata.

Capovolgere la piastra e perforare i fori sul fondo. Leggere l'assorbanza della piastra a 630 nanometri senza coperchio. Posizionare un coperchio interno sulla pellicola sigillante superiore per assicurarsi che gli anelli di condensazione circondono i pozzi perforati, quindi posizionare il coperchio esterno sulla piastra.

Posizionare la piastra di alimentazione a faccia in su sull'accoppiatore in modo che le guide allineino i fori appropriati della piastra di alimentazione e della piastra di fame. Assicurarsi che l'accoppiatore e le piastre siano orientati correttamente. Una volta caricate tutte le piastre di alimentazione sugli accoppiatori, aprire i fori per le piastre regolando le strisce di barriera sull'accoppiatore.

Posizionare l'accoppiatore e i gruppi di piastre nel contenitore secondario. Posizionare la metà inferiore di una scatola di pipetta contenente asciugamani di carta imbevuti in ciascun contenitore secondario per fornire umidità. Chiudere il coperchio del contenitore secondario e trasferirlo in un ambiente controllato.

Lasciare che le mosche consumino per 22 ore. Dopo le 22 ore di esposizione, controllare ogni piastra per le mosche morte e aggiornare il layout della piastra di conseguenza. Dopo aver controllato tutte le piastre, anestetizzare le mosche in massa pompando CO2 all'interno del contenitore secondario.

Dopo circa 60 secondi, assicurarsi che tutte le mosche siano immobilizzate. Picchiettare delicatamente le mosche nella piastra di fame e sostituire le strisce di barriera di plastica. Rimuovere le piastre di alimentazione per la lettura.

Rileggere l'assorbanza della piastra a 630 nanometri. Ripetere il processo fino a quando tutte le piastre non sono state lette. L'evaporazione è stata quantificata per ogni pozzo ed è stato trovato per determinare se esistono correlazioni tra i pozzi delle singole piastre.

I coefficienti di correlazione di Pearson per l'evaporazione rispetto alle righe e l'evaporazione rispetto alle colonne sono stati calcolati per valutare le tendenze tra l'evaporazione e le posizioni dei pozzi. Il consumo per le mosche Canton-SB di tre-cinque giorni è stato quantificato per stabilire la validità del protocollo. Alle mosche è stata data una scelta tra una soluzione di saccarosio al 4% con estratto di lievito all'1% e una soluzione di saccarosio al 4% integrata con etanolo al 15% ed estratto di lievito all'1%.

Sia i maschi che le femmine hanno mostrato una preferenza schiacciante per la soluzione con etanolo ed estratto di lievito. È essenziale mantenere la coerenza durante la costruzione delle piastre di alimentazione, assicurando che ogni mosca sia presentata con uno scenario di consumo identico per quanto riguarda il volume del cibo, l'evaporazione e l'accesso. Questa tecnica consentirà ai ricercatori nel campo della Drosophila di eseguire saggi ad alto rendimento per comportamenti di consumo e preferenza con una maggiore produttività e a costi inferiori rispetto ai metodi tradizionali.