Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila
14 giugno 2021
Il test dell'alimentatore di micropiasche offre un metodo economico e ad alta produttività per quantificare il consumo di alimenti liquidi in Drosophila. Un dispositivo stampato in 3D collega una micropiastra a 96 pozzette in cui le mosche sono alloggiate a una micropiastra da 1536 pozzene da cui le mosche consumano una soluzione di alimentazione con un colorante tracciante. Il declino del volume della soluzione viene misurato spettrofotometricamente.
Il test dell'alimentatore a micropiasche fornisce un metodo semplice, ad alto rendimento ed economico per misurare il comportamento di alimentazione della Drosophila e offre molteplici vantaggi rispetto ad altri metodi più elaborati. Quantificare il consumo misurando l'assorbanza con un lettore di piastre elimina le misurazioni manuali e ovvia all'immissione manuale dei dati. I dati sono anche suscettibili di estrazione ed elaborazione programmatica.
Con questo test ad alto rendimento possiamo quantificare il consumo di nutrienti idrosolubili, farmaci, prodotti farmaceutici o tossine e il sistema può essere modificato per applicazioni a una varietà di specie di insetti. Iniziare versando l'agarosio fuso in una depressione di reagente ed erogare 80 microlitri di agarosio fuso in ciascun pozzetto di una micropiastra a 96 pozzetto usando una pipetta multicanale. Conservare in frigorifero l'agarose avanzato per un massimo di una settimana in un sacchetto sigillato e riforlo per creare piastre aggiuntive.
Se le strisce di barriera sono troppo larghi, arrotolarle attorno al dito per dare loro la curvatura per tenerle nei canali. Inserire le strisce barriera nei canali della striscia barriera per preparare gli accoppiatori. Fissare l'accoppiatore a una piastra di fame, assicurandosi di non utilizzare l'accoppiatore per manipolare la piastra in quanto l'accoppiatore potrebbe scivolare via.
Assicurarsi che l'angolo angolato dell'accoppiatore corrisponda all'angolo angolato della micropiastra per mantenere l'orientamento corretto. Sotto anestesia CO2, ordinare mosche da tre a cinque giorni. Carica le singole mosche per colonna nella piastra di fame.
Chiudi ogni colonna mentre si riempie regolando la sua striscia barriera in posizione chiusa. Registrare con attenzione il layout del campione all'interno della micropiastra. Una volta riempita la piastra di fame, lasciare che le mosche si riprendano spontaneamente dopo aver rimosso la CO2 e farle morire di fame per sei ore a partire dal loro tempo di anestesia iniziale.
Preparare 10 millilitri di cibo liquido in un tubo conico da 15 millilitri sciogliendo 0,4 grammi di saccarosio e 0,1 grammi di estratto di lievito in 10 millilitri di acqua distillata. Vortice il tubo fino a quando i solidi si dissolvono completamente. Aggiungere 40 microlitri di soluzione stock di colorante e trasferire il cibo liquido in una siringa da 10 millilitri con punta con un filtro da 0,45 micrometri.
Filtrare circa 1,5 millilitri della soluzione alla volta in un tubo microcentrifuga da 1,7 millilitri. Mettere da parte la siringa contenente la soluzione e filtrare la soluzione aggiuntiva secondo necessità durante la preparazione della piastra di alimentazione. Preparare una piastra di alimentazione sigillando il fondo di una micropiastra a 1536 pozzetti con un film sigillante.
Utilizzare una paletta di tenuta per aderire completamente al film. Quindi, tagliare la pellicola in eccesso dai bordi sinistro e destro con una lama di rasoio. Erogare 10 microlitri del cibo liquido filtrato a colonna nel pozzo in alto a sinistra per ogni gruppo di quattro pozzi della micropiastra da 1536 pozzi.
Una volta riempiti tutti i pozzetti, applicare un film sigillante sulla parte superiore della piastra, seguendo gli stessi passaggi utilizzati per sigillare il fondo della micropiastra. Ripetere per il numero desiderato di piastre. Centrifugare le piastre a 200 volte G per 10 secondi per depositare il fluido.
Non lasciare raffreddare la piastra poiché ciò può causare l'accumulo di condensa nei pozzetti, oscurando le letture di assorbanza. Perforare i pozzetti sulla superficie superiore della piastra con lo strumento sonda ad ago dotato di un ago da 0,25 millimetri di diametro, utilizzando lo stesso ordine di perforazione utilizzato durante l'erogazione delle soluzioni. Pulire l'ago tra le soluzioni per evitare la contaminazione incrociata.
Capovolgere la piastra e perforare i fori sul fondo. Leggere l'assorbanza della piastra a 630 nanometri senza coperchio. Posizionare un coperchio interno sulla pellicola sigillante superiore per assicurarsi che gli anelli di condensazione circondono i pozzi perforati, quindi posizionare il coperchio esterno sulla piastra.
Posizionare la piastra di alimentazione a faccia in su sull'accoppiatore in modo che le guide allineino i fori appropriati della piastra di alimentazione e della piastra di fame. Assicurarsi che l'accoppiatore e le piastre siano orientati correttamente. Una volta caricate tutte le piastre di alimentazione sugli accoppiatori, aprire i fori per le piastre regolando le strisce di barriera sull'accoppiatore.
Posizionare l'accoppiatore e i gruppi di piastre nel contenitore secondario. Posizionare la metà inferiore di una scatola di pipetta contenente asciugamani di carta imbevuti in ciascun contenitore secondario per fornire umidità. Chiudere il coperchio del contenitore secondario e trasferirlo in un ambiente controllato.
Lasciare che le mosche consumino per 22 ore. Dopo le 22 ore di esposizione, controllare ogni piastra per le mosche morte e aggiornare il layout della piastra di conseguenza. Dopo aver controllato tutte le piastre, anestetizzare le mosche in massa pompando CO2 all'interno del contenitore secondario.
Dopo circa 60 secondi, assicurarsi che tutte le mosche siano immobilizzate. Picchiettare delicatamente le mosche nella piastra di fame e sostituire le strisce di barriera di plastica. Rimuovere le piastre di alimentazione per la lettura.
Rileggere l'assorbanza della piastra a 630 nanometri. Ripetere il processo fino a quando tutte le piastre non sono state lette. L'evaporazione è stata quantificata per ogni pozzo ed è stato trovato per determinare se esistono correlazioni tra i pozzi delle singole piastre.
I coefficienti di correlazione di Pearson per l'evaporazione rispetto alle righe e l'evaporazione rispetto alle colonne sono stati calcolati per valutare le tendenze tra l'evaporazione e le posizioni dei pozzi. Il consumo per le mosche Canton-SB di tre-cinque giorni è stato quantificato per stabilire la validità del protocollo. Alle mosche è stata data una scelta tra una soluzione di saccarosio al 4% con estratto di lievito all'1% e una soluzione di saccarosio al 4% integrata con etanolo al 15% ed estratto di lievito all'1%.
Sia i maschi che le femmine hanno mostrato una preferenza schiacciante per la soluzione con etanolo ed estratto di lievito. È essenziale mantenere la coerenza durante la costruzione delle piastre di alimentazione, assicurando che ogni mosca sia presentata con uno scenario di consumo identico per quanto riguarda il volume del cibo, l'evaporazione e l'accesso. Questa tecnica consentirà ai ricercatori nel campo della Drosophila di eseguire saggi ad alto rendimento per comportamenti di consumo e preferenza con una maggiore produttività e a costi inferiori rispetto ai metodi tradizionali.
Panoramica
Il micropiatto feeder assay fornisce un metodo ad alto rendimento per quantificare il comportamento alimentare della Drosophila. Questo approccio economico utilizza un dispositivo stampato in 3D per collegare i micropiatti, consentendo una misurazione efficiente del consumo di cibo liquido.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia comportamentale
- Entomologia
Sfondo
- Misurare il comportamento alimentare nella Drosophila è cruciale per comprendere le preferenze nutrizionali.
- I metodi tradizionali possono essere laboriosi e meno efficienti.
- Il micropiatto feeder assay semplifica questo processo.
- Utilizza misurazioni spettrofotometriche per la raccolta dei dati.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo ad alto rendimento per valutare il consumo di cibo nella Drosophila.
- Facilitare la quantificazione di vari nutrienti e sostanze.
- Migliorare l'efficienza degli studi sul comportamento alimentare.
Metodi utilizzati
- Preparazione dell'agarosa e dei micropiatti per gli assay di alimentazione.
- Smistamento e anestesia delle mosche per esperimenti di alimentazione controllata.
- Misurazione dell'assorbanza per quantificare il consumo di cibo.
- Analisi dei dati per individuare tendenze nel comportamento alimentare e nelle preferenze.
Risultati principali
- Le mosche hanno mostrato una preferenza per il cibo contenente etanolo ed estratto di lievito.
- La raccolta dei dati è stata semplificata attraverso misurazioni automatiche dell'assorbanza.
- I tassi di evaporazione sono stati quantificati e analizzati per le correlazioni.
- L'assay si è dimostrato efficace per studi di alimentazione ad alto rendimento.
Conclusioni
- Il micropiatto feeder assay è uno strumento prezioso per la ricerca sulla Drosophila.
- Consente una misurazione efficiente e accurata del comportamento alimentare.
- Questo metodo può essere adattato per varie specie di insetti e applicazioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying consumption in model organisms supports target validation and phenotypic screening in early discovery. The microplate feeder assay enables high-throughput measurement of liquid food intake in Drosophila, providing quantitative data for mechanistic de-risking of nutritional, toxicological, or pharmacological interventions. This approach improves predictive confidence in lead identification by standardizing consumption metrics across large sample sets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals in a genetically tractable model.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, absorbance-based measurement of liquid food intake.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating reproducible consumption data for compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by isolating individual fly consumption in multi-well formats.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sealed microplates and controlled evaporation correction.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse via 3D-printed couplers that synchronize 96- and 1536-well microplates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling dose-response analysis of consumable compounds.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when assessing behavioral responses to substances like ethanol or yeast extract.
- Disease-Relevant System: Supports studies of consumption-associated traits with environmental and pharmacological variables.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting quantitative behavioral phenotyping.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through quantified liquid food intake.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via absorbance measurements before and after consumption.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including evaporation correction and Pearson correlation analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via preference testing between sucrose and ethanol-supplemented solutions.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through 3D-printed couplers and sealing protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in consumption-related phenotypes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through microplate-based absorbance readings and barrier strip controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling high-throughput preference and consumption assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative intake data across compound libraries.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in Drosophila handling, microplate preparation, and spectrophotometry.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include plate readers capable of 630 nm absorbance and 3D-printed coupler systems.
- Cross-team standardization requirements for sealing, perforation, and environmental controls to minimize condensation and evaporation artifacts.
- Adaptation considerations across model systems, noting potential for extension to other insect species with modified food formulations.
- Practical limitations supported by source material: evaporation must be quantified and corrected; chilling plates causes condensation that obscures readings; consistent orientation of coupler and microplates is required for proper well access.
