Name: Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Impara a preparare griglie di campionamento a temperature elevate fino a 70 °C per esperimenti di cryo-EM. Questo metodo consente di studiare le strutture proteiche dipendenti dalla temperatura con rilevanza funzionale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano il Dr. Hervé Remigy di Thermo Fisher Scientific per gli utili consigli. Gli esperimenti crio-EM sono stati eseguiti presso l'Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM è sostenuto da Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) e Taiwan Protein Project (sovvenzione n. AS-KPQ-109-TPP2). Gli autori ringraziano anche la signora Hui-Ju Huang per l'assistenza nella preparazione del campione.

NOTA: Questo protocollo mira ad utilizzare un apparato di vetrificazione commerciale modificato per preparare i campioni di microscopia crioelettronica (crio-EM) a temperature specifiche, in particolare superiori a 37 °C. La configurazione sperimentale complessiva è mostrata nella Figura 1. Il protocollo utilizza 55 °C come esempio. Per le condizioni specifiche ad altre temperature, fare riferimento alla tabella supplementare 2 nel riferimento12.
1. Preparazione dell'apparecchio di vetrificazione
<ol><li>Fare un foro di 1 cm in un tubo di centrifuga da 50 ml sulla sua estremità chiusa.</li>
	<li>Posizionare il tubo nella camera dell'apparato di vetrificazione all'uscita dell'acqua ad ultrasuoni, come mostrato nella Figura 2. NOTA: Lo scopo è ridurre al minimo la condensa dell'acqua guidando il vapore acqueo verso lo scambiatore di calore attraverso il tubo prima di raggiungere l'intera camera.</li>
	<li>Impostare la temperatura dell'apparecchio di vetrificazione alla temperatura specificata (ad esempio, 55 °C, come mostrato nella Figura 3) e consentire alla camera dell'apparecchio di vetrificazione di raggiungere 55 °C e il 100% di umidità relativa. Lasciare riposare per almeno mezz'ora per stabilizzare le condizioni prima di iniziare l'esperimento.</li>
</ol>2. Riscaldamento del campione e degli strumenti
<ol><li>Posizionare il bagnomaria su una piastra riscaldante e impostare la piastra alla temperatura desiderata (qui 55 °C). Controllare con un termometro che l'acqua raggiunga i 55 °C.</li>
	<li>Incubare il campione a bagnomaria e preriscaldare la punta della pipetta sul bordo della piastra riscaldante per 2 minuti o più prima dell'esperimento di sterilizzazione a secco. NOTA: L'impostazione della temperatura massima per la camera dell'apparecchio di vetrificazione è 60 °C. Per preparare griglie a temperatura più elevata per esperimenti cyro-EM (ad esempio, 70 °C), il campione viene incubato nel bagno d'acqua a 80 °C e la media tra la temperatura del campione e la temperatura dell'apparato di vetrificazione è stimata essere la temperatura effettiva del campione sulla griglia (70 °C in questo caso). Vedere la sezione Discussione per ulteriori dettagli e limitazioni su questa stima.</li>
</ol>3. Preparazione per l'esperimento di blotting
<ol><li>Glow scarica una griglia supportata da carbonio holey a 25 mA per 30 s, o in alternativa ai valori a seconda del dispositivo utilizzato.</li>
	<li>Incubare le pinzette con la griglia nell'apparecchio di vetrificazione per 2 minuti o più.</li>
	<li>Riempire il contenitore di etano con etano secondo le procedure standard. Non lasciare che l'etano trabocchi. NOTA: questo passaggio richiede circa 10 minuti e deve essere seguito immediatamente con l'esperimento di blotting per evitare il congelamento.</li>
	<li>Posizionare la carta da filtro per vetrificazione nella camera dell'apparecchio di vetrificazione non prima di 5 minuti prima dell'esperimento di blotting. NOTA: Posizionare la carta da filtro nella camera troppo presto causerà un consumo eccessivo.</li>
</ol>4. Esperimento di blotting
NOTA: Quando si tiene la griglia, assicurarsi che la griglia sia stabile e che vi sia un'area di contatto minima con le pinzette (Figura 4). Questo viene fatto per mantenere la migliore efficienza di raffreddamento dell'etano e per evitare il ghiaccio non vetroso.
<ol><li>Utilizzare una punta per pipetta per applicare 7-9 μL del campione alla griglia. Quindi attendere 1-2 s, asciugare per 1-1,5 s e immergere rapidamente il campione in etano liquido.</li>
	<li>Trasferire la griglia dall'etano liquido alla scatola criogenica, che viene immagazzinata in azoto liquido. NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con molta attenzione perché la pinzetta è ancora calda, quindi l'intero serbatoio di raffreddamento è pieno di vapore in questo momento.</li>
</ol>5. Controllo qualità delle griglie
<ol><li>Ritaglia le griglie e caricale su uno strumento crio-EM.</li>
	<li>Utilizzare lo schermo di visualizzazione dello strumento crio-EM e la funzione a basso dosaggio del software per schermare le condizioni del ghiaccio sulla griglia e la distribuzione del campione sulla griglia. NOTA: Spesso, le griglie sono molto secche o lo strato di ghiaccio è troppo spesso. Il tasso di successo delle griglie preparate ad alte temperature è sostanzialmente inferiore a quello a temperatura ambiente o 4 °C. I risultati rappresentativi di buone griglie e griglie non soddisfacenti sono mostrati nella sezione successiva.</li>
	<li>Se la qualità della griglia risultante non è buona, ripetere il processo di preparazione della griglia con varie condizioni (come tempo di attesa, tempo di asciugatura, ecc.). Se la qualità della griglia risultante è buona, ripetere gli stessi passaggi per creare griglie a una temperatura diversa.</li>
</ol>6. Raccolta dei dati
<ol><li>Trasferire le griglie di buona qualità su uno strumento crio-EM ad alta risoluzione.</li>
	<li>Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati secondo procedure stabilite. NOTA: Come mostrato nella nostra precedente pubblicazione, la risoluzione della struttura non è influenzata dall'alta temperatura12.</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Nella fase 1 del protocollo, assicurarsi che il tubo della centrifuga sia stato installato bene e non cada quando l'esperimento è in corso. A causa dell'accumulo di un gran numero di goccioline d'acqua nella camera, che potrebbero modificare la capacità di adsorbimento della carta da filtro, si raccomanda che il tempo complessivo dell'esperimento non superi i 30 minuti dopo che la camera dell'apparato di vetrificazione ha raggiunto la temperatura di equilibrio. Se il tempo di funzionamento supera i 30 minuti, l'operatore...

La tecnologia crio-EM per risolvere le strutture dei complessi proteici ha continuato a migliorare, in particolare nella direzione di ottenere strutture ad alta risoluzione 1,2. Nel frattempo, anche il panorama della sua applicazione è stato ampliato variando le condizioni del campione come pH o leganti prima del processo di vetrificazione3, che prevede la preparazione di griglie di campionamento seguite dal congelamento a tuffo 4,5. Un'altra condizione importante è la temperatura. Sebbene gli esperimenti crio-EM, come la cristallografia a raggi X, vengano eseguiti a basse temperature, la struttura risolta dalla crio-EM riflette la struttura allo stato di soluzione prima della vetrificazione. Fino a poco tempo fa, la maggior parte degli studi crio-EM di analisi di singole particelle (SPA) utilizza campioni che vengono conservati sul ghiaccio (cioè a 4 °C) prima della vetrificazione6, sebbene un certo numero di studi utilizzi campioni a temperatura ambiente di circa 7,8,9,10 o fino a 42 °C 11. In un recente rapporto, abbiamo eseguito studi dipendenti dalla temperatura dell'enzima cheto-acido riduttoisomerasi (KARI) dall'archeone termofilo Sulfolobus solfataricus (Sso) a sei diverse temperature da 4 ° C a 70 ° C12. I nostri studi suggeriscono che è importante preparare griglie di campioni a temperature funzionalmente rilevanti e che la crio-EM è l'unico metodo strutturale praticamente fattibile per risolvere la struttura dello stesso complesso proteico a più temperature.
La principale difficoltà per la vetrificazione ad alte temperature è ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere ghiaccio sottile. Qui riportiamo il protocollo dettagliato utilizzato per la preparazione di griglie campione ad alte temperature nel nostro precedente studio di Sso-KARI 12. Partiamo dal presupposto che i lettori o gli spettatori abbiano già esperienza nella preparazione complessiva del campione e nelle procedure di elaborazione dei dati per gli esperimenti crio-EM e sottolineiamo gli aspetti rilevanti per l'alta temperatura.

<table><tbody><tr><td>Falcon provetta Falcon</td><td></td><td>352070</td><td>formato: 50 mL</td></tr><tr><td>Carta filtro</td><td>Ted Pella</td><td>47000-100</td><td>&Oslash; 55/20mm, grado 595</td></tr><tr><td>HI1210</td><td>Leica</td><td></td> bagno <td>d'acqua</td></tr><tr><td>K100X</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td></td><td>scarica a bagliore</td></tr><tr><td>Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu griglia</td><td>Ted Pella</td><td>658-200-CU-100</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios G3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1063996</td><td>imaging a basso dosaggio</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Pinzetta</td><td>Ted Pella</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-em

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

Le griglie di campioni per esperimenti di crio-microscopia elettronica (crio-EM) sono solitamente preparate ad una temperatura ottimale per la conservazione di campioni biologici, per lo più a 4 °C e occasionalmente a temperatura ambiente. Recentemente, abbiamo scoperto che la struttura proteica risolta a bassa temperatura potrebbe non essere funzionalmente rilevante, in particolare per le proteine degli archei termofili. È stata sviluppata una procedura per preparare campioni proteici a temperature più elevate (fino a 70 °C) per l'analisi crio-EM. Abbiamo dimostrato che le strutture provenienti da campioni preparati a temperature più elevate sono funzionalmente rilevanti e dipendenti dalla temperatura. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni ad alta temperatura, usando 55 °C come esempio. L'esperimento si è avvalso di un apparecchio di vetrificazione modificato mediante una provetta da centrifuga supplementare e i campioni sono stati incubati a 55 °C. Le procedure dettagliate sono state messe a punto per ridurre al minimo la condensa del vapore e ottenere un sottile strato di ghiaccio sulla griglia. Vengono forniti esempi di esperimenti riusciti e falliti.

La panoramica del basso ingrandimento è mostrata nella Figura 5A,B. Il pannello A è un esempio di griglia di successo. C'è un gradiente di ghiaccio dall'alto a sinistra (più spesso) al basso a destra (più sottile o vuoto). Tale griglia rende più facile trovare uno spessore appropriato dello strato di ghiaccio nell'area centrale adatto alla raccolta dei dati, come le caselle blu e verdi. La griglia B è troppo asciutta. I quadrati nella griglia hanno un contrasto luminoso, il ...

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni a temperature fino a 70 °C, prima del congelamento a immersione per esperimenti crio-EM.

Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

Le funzioni delle proteine dipendono dalla temperatura e sono ottimali alla temperatura. Questo protocollo fornisce un modo per risolvere le strutture proteiche a temperature più elevate. Questo approccio può fornire strutture funzionalmente rilevanti e migliorare la comprensione della dipendenza dalla temperatura delle strutture proteiche.A dimostrare la procedura sarà Yuan-Chih Chang, Manager della struttura Academia Sinica Cryo EM. Inizia facendo un foro di un centimetro in un tubo di centrifuga da 50 millimetri sulla sua estremità chiusa. Posizionare il tubo nella camera dell'apparato di vetrificazione all'uscita dell'acqua ad ultrasuoni.Impostare la temperatura dell'apparecchio di vetrificazione alla temperatura specificata e consentire alla camera dell'apparecchio di vetrificazione di raggiungere 55 gradi Celsius e il 100% di umidità relativa. Lasciare riposare per almeno mezz'ora per stabilizzare le condizioni prima di iniziare l'esperimento. Posizionare il bagno d'acqua su una piastra riscaldante e impostare la piastra calda alla temperatura desiderata.Controllare con un termometro per assicurarsi che l'acqua raggiunga i 55 gradi Celsius. Incubare il campione a bagnomaria e preriscaldare la punta della pipetta sul bordo della piastra riscaldante per due minuti o più prima dell'esperimento di blotting. Glow scarica una griglia supportata da carbonio holey a 25 milliampere per 30 secondi.Posizionare la carta da filtro per vetrificazione nella camera dell'apparecchio di vetrificazione non prima di cinque minuti prima dell'esperimento di blotting. Incubare le pinzette con la griglia nell'apparecchio di vitrificazione per due minuti o più. Costruire il contenitore di etano con etano secondo le procedure standard, assicurandosi che l'etano non trabocchi.Utilizzare una pipetta per applicare da sette a nove microlitri del campione alla griglia. Quindi attendere uno o due secondi, asciugare per uno o un secondo e mezzo e immergere rapidamente il campione nell'etano liquido. Trasferire la griglia dall'etano liquido alla crioscatola immagazzinata in azoto liquido.Aggancia le griglie e scaricale per acquisire il microscopio elettronico o lo strumento Cryo EM. Utilizzare lo schermo dello strumento Cryo EM e la funzione a basso dosaggio del software, per schermare le condizioni del ghiaccio sulla griglia e la distribuzione del campione sulla griglia. Se la qualità della griglia risultante non è buona, ripetere il processo di preparazione della griglia con varie condizioni come tempi di attesa, tempi di asciugatura, eccetera.Se la qualità della griglia risultante è buona, ripetere gli stessi passaggi per creare griglie a una temperatura diversa. Trasferisci le griglie di buona qualità su uno strumento Cryo EM ad alta risoluzione. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati secondo procedure stabilite.Nel caso della griglia di successo, si è formato un gradiente di ghiaccio con ghiaccio più spesso in alto a sinistra della griglia e ghiaccio più sottile in basso a destra. Le caselle blu e verdi adatte alla raccolta dei dati sono state osservate nella griglia di successo. Un contrasto luminoso è stato osservato nell'altra griglia.Indica uno strato sottile, di ghiaccio o un'assenza di ghiaccio. Solo due quadrati sono risultati adatti per la raccolta dei dati nella seconda griglia. Una delle griglie consisteva principalmente di ghiaccio sotto forma di cristallino, che non era adatto per la raccolta dei dati.D'altra parte, l'altra griglia ha mostrato che lo strato di ghiaccio era per lo più in uno stato amorfo adatto alla raccolta dei dati. La preparazione del contenitore e degli altri deve essere completa in base a un punto temporale. Il controllo del tempo e la finitura dell'esperimento in modo rapido e preciso sono molto importanti.A seconda dei risultati ottenuti utilizzando questo protocollo, il ricercatore potrebbe dover essere più attento nell'impostare le semplici condizioni.

preparation-of-high-temperature-sample-grids-for-cryo-em

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Vi presentiamo un protocollo su come utilizzare high-throughput crio-elettroni tomografia per determinare alta risoluzione in strutture in situ di macchine molecolari. Il protocollo permette di grandi quantità di dati da elaborare, evita i colli di bottiglia comuni e riduce i tempi di inattività delle risorse, permettendo all'utente di concentrarsi su importanti questioni biologiche.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Metodi per la preparazione di volumi di campione dimensioni nanolitro per microscopia elettronica di trasmissione e uno strumento è presentato. Non macchiare di carta sono necessari passaggi, evitando così le conseguenze pregiudizievoli, che questo può avere per le proteine, significativamente riducendo la perdita del campione e consentendo l'analisi della singola cella lysata per proteomica di visual.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'uso di un dispositivo di creazione rapida della griglia sia per la creazione rapida della griglia che per la miscelazione e il congelamento rapidi per condurre esperimenti risolti nel tempo.

Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo

Il protocollo qui presentato descrive l'uso di Spotiton, un nuovo sistema robotico, per fornire due campioni di interesse su una griglia di nanofili auto-traspiranti che si mescolano per un minimo di 90 ms prima della vetrificazione nel criogeno liquido.

Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

Il rapporto segnale-rumore dei dati è una delle considerazioni più importanti nell'esecuzione di misurazioni di diffrazione a raggi X da microcristalli. La beamline VMXm fornisce un ambiente a basso rumore e microbeam per tali esperimenti. Qui, descriviamo i metodi di preparazione del campione per il montaggio e il raffreddamento di microcristalli per VMXm e altre linee di cristallografia macromolecolare microfocus.

Una pipeline di preparazione del campione per microcristalli presso la linea di fascio VMXm

La determinazione della struttura dei complessi macromolecolari utilizzando il crioEM è diventata di routine per alcune classi di proteine e complessi. Qui, questa pipeline è riassunta (preparazione del campione, screening, acquisizione ed elaborazione dei dati) e i lettori sono indirizzati verso ulteriori risorse dettagliate e variabili che possono essere modificate nel caso di campioni più impegnativi.

Microscopia crioelettronica a particella singola: dal campione alla struttura

Questo manoscritto delinea il metodo blot-and-plunge per congelare manualmente i campioni biologici per la microscopia elettronica criogenica a singola particella.

Congelamento manuale blot-and-plunge di campioni biologici per microscopia elettronica criogenica a particella singola

Qui, presentiamo una pipeline per la fresatura di fasci ionici focalizzati correlativi 3D sulla guida della preparazione di campioni cellulari per la tomografia crioelettronica. La posizione 3D delle proteine di interesse marcate con fluorescenza viene prima determinata mediante microscopia a criofluorescenza e quindi mirata per la fresatura. Il protocollo è adatto per cellule di mammiferi, lieviti e batteri.

Preparazione del campione mediante fresatura a fascio ionico focalizzato correlativo 3D per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione

Questo metodo fornisce un protocollo accessibile e flessibile per la preparazione di griglie di microscopia elettronica (EM) per la criotografia cellulare in situ e la microscopia ottica ed elettronica correlata (CLEM).

Preparazione del campione per la criotomografia in situ di cellule di mammifero

Viene fornito un protocollo passo-passo per la fabbricazione di griglie di affinità per streptavidina da utilizzare in studi strutturali di campioni macromolecolari impegnativi mediante microscopia crioelettronica.

Fabbricazione di griglia di affinità streptavidina per la preparazione di campioni di microscopia crioelettronica

Questo protocollo presenta un metodo pratico che utilizza Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) come esempio per affrontare la distribuzione irregolare delle particelle attraverso l'ottimizzazione della preparazione del campione, fornendo un riferimento per i ricercatori per chiarire in modo efficiente le strutture macromolecolari utilizzando la microscopia elettronica criogenica (cryo-EM).

Ottimizzazione della preparazione dei campioni per la microscopia elettronica criogenica

Impara a preparare griglie di campionamento a temperature elevate fino a 70 °C per esperimenti di cryo-EM. Questo metodo consente di studiare le strutture proteiche dipendenti dalla temperatura con rilevanza funzionale.

Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM

Esplora altri video