Preparazione di griglie di campionamento ad alta temperatura per crio-EM
26 luglio 2021
Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie di campioni a temperature fino a 70 °C, prima del congelamento a immersione per esperimenti crio-EM.
Le funzioni delle proteine dipendono dalla temperatura e sono ottimali alla temperatura. Questo protocollo fornisce un modo per risolvere le strutture proteiche a temperature più elevate. Questo approccio può fornire strutture funzionalmente rilevanti e migliorare la comprensione della dipendenza dalla temperatura delle strutture proteiche.
A dimostrare la procedura sarà Yuan-Chih Chang, Manager della struttura Academia Sinica Cryo EM. Inizia facendo un foro di un centimetro in un tubo di centrifuga da 50 millimetri sulla sua estremità chiusa. Posizionare il tubo nella camera dell'apparato di vetrificazione all'uscita dell'acqua ad ultrasuoni.
Impostare la temperatura dell'apparecchio di vetrificazione alla temperatura specificata e consentire alla camera dell'apparecchio di vetrificazione di raggiungere 55 gradi Celsius e il 100% di umidità relativa. Lasciare riposare per almeno mezz'ora per stabilizzare le condizioni prima di iniziare l'esperimento. Posizionare il bagno d'acqua su una piastra riscaldante e impostare la piastra calda alla temperatura desiderata.
Controllare con un termometro per assicurarsi che l'acqua raggiunga i 55 gradi Celsius. Incubare il campione a bagnomaria e preriscaldare la punta della pipetta sul bordo della piastra riscaldante per due minuti o più prima dell'esperimento di blotting. Glow scarica una griglia supportata da carbonio holey a 25 milliampere per 30 secondi.
Posizionare la carta da filtro per vetrificazione nella camera dell'apparecchio di vetrificazione non prima di cinque minuti prima dell'esperimento di blotting. Incubare le pinzette con la griglia nell'apparecchio di vitrificazione per due minuti o più. Costruire il contenitore di etano con etano secondo le procedure standard, assicurandosi che l'etano non trabocchi.
Utilizzare una pipetta per applicare da sette a nove microlitri del campione alla griglia. Quindi attendere uno o due secondi, asciugare per uno o un secondo e mezzo e immergere rapidamente il campione nell'etano liquido. Trasferire la griglia dall'etano liquido alla crioscatola immagazzinata in azoto liquido.
Aggancia le griglie e scaricale per acquisire il microscopio elettronico o lo strumento Cryo EM. Utilizzare lo schermo dello strumento Cryo EM e la funzione a basso dosaggio del software, per schermare le condizioni del ghiaccio sulla griglia e la distribuzione del campione sulla griglia. Se la qualità della griglia risultante non è buona, ripetere il processo di preparazione della griglia con varie condizioni come tempi di attesa, tempi di asciugatura, eccetera.
Se la qualità della griglia risultante è buona, ripetere gli stessi passaggi per creare griglie a una temperatura diversa. Trasferisci le griglie di buona qualità su uno strumento Cryo EM ad alta risoluzione. Eseguire la raccolta e l'analisi dei dati secondo procedure stabilite.
Nel caso della griglia di successo, si è formato un gradiente di ghiaccio con ghiaccio più spesso in alto a sinistra della griglia e ghiaccio più sottile in basso a destra. Le caselle blu e verdi adatte alla raccolta dei dati sono state osservate nella griglia di successo. Un contrasto luminoso è stato osservato nell'altra griglia.
Indica uno strato sottile, di ghiaccio o un'assenza di ghiaccio. Solo due quadrati sono risultati adatti per la raccolta dei dati nella seconda griglia. Una delle griglie consisteva principalmente di ghiaccio sotto forma di cristallino, che non era adatto per la raccolta dei dati.
D'altra parte, l'altra griglia ha mostrato che lo strato di ghiaccio era per lo più in uno stato amorfo adatto alla raccolta dei dati. La preparazione del contenitore e degli altri deve essere completa in base a un punto temporale. Il controllo del tempo e la finitura dell'esperimento in modo rapido e preciso sono molto importanti.
A seconda dei risultati ottenuti utilizzando questo protocollo, il ricercatore potrebbe dover essere più attento nell'impostare le semplici condizioni.
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Panoramica
Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di griglie campione a temperature elevate fino a 70 °C, prima del congelamento rapido per esperimenti di microscopia crioelettronica (cryo-EM). Questo approccio migliora la comprensione della dipendenza dalla temperatura delle strutture proteiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia elettronica criogenica (cryo-EM)
- Analisi della struttura proteica
- Effetti della temperatura sulle proteine
Sfondo
- Le funzioni delle proteine dipendono dalla temperatura.
- Le temperature ottimali possono variare a seconda delle diverse proteine.
- Comprendere le strutture proteiche a temperature elevate è fondamentale.
- Questo protocollo ha lo scopo di fornire strutture funzionalmente rilevanti.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per la preparazione di griglie campione a temperature elevate.
- Migliorare la comprensione della struttura e della funzione delle proteine.
- Illustrare la procedura per esperimenti di microscopia elettronica criogenica (cryo-EM).
Metodi Utilizzati
- Creazione di un foro in un tubo da centrifuga.
- Utilizzo di un apparato di vetrificazione.
- Congelamento rapido dei campioni per microscopia crioelettronica (cryo-EM).
- Dimostrazione a cura di Yuan-Chih Chang.
Risultati principali
- Preparazione riuscita di griglie campione ad alte temperature.
- Migliore comprensione delle strutture proteiche dipendenti dalla temperatura.
- Procedura dimostrata per un'analisi efficace con microscopia crioelettronica.
- Potenziale rilevanza funzionale in biologia strutturale.
Conclusioni
- Il protocollo consente lo studio delle proteine a temperature più elevate.
- Fornisce informazioni sulla dipendenza dalla temperatura delle strutture proteiche.
- Questo metodo può essere vantaggioso per futuri esperimenti di criomicroscopia elettronica (cryo-EM).
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La preparazione della griglia del campione ad alta temperatura per la microscopia criogenica (cryo-EM) consente l'analisi strutturale di proteine in condizioni termiche fisiologicamente rilevanti, colmando una lacuna fondamentale nello studio di bersagli termofili. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella validazione dei bersagli, garantendo che le conformazioni osservate rispecchino stati funzionali. L'integrazione della preparazione delle griglie per cryo-EM con controllo della temperatura supporta l'avanzamento calibrato sui rischi di asset strutturalmente complessi o sensibili alla temperatura nelle fasi iniziali dei percorsi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi strutturale di proteine a temperature corrispondenti ai loro ambienti nativi o funzionali.
- Migliora la riduzione dei rischi biologici rivelando stati conformazionali dipendenti dalla temperatura.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine termofile e sensibili alla temperatura.
- Facilita il triage del portafoglio distinguendo gli artefatti dalle strutture fisiologicamente rilevanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara griglie di criomicroscopia elettronica validate per flussi di lavoro di imaging ad alta risoluzione successivi.
- Standardizza la valutazione della qualità delle griglie attraverso un controllo riproducibile di temperatura e umidità.
- Permette una valutazione quantitativa dello spessore del ghiaccio e della distribuzione del campione per la preparazione alla selezione.
- Supporta una valutazione affidabile dei composti garantendo la rilevanza strutturale delle proteine bersaglio del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati strutturali a condizioni di temperatura rilevanti per la malattia o specifiche per l'organismo.
- Migliora la continuità traduttiva riducendo le discrepanze tra gli stati proteici in vitro e in vivo.
- Riduce i rischi nell'avanzamento preclinico confermando la rilevanza funzionale dei risultati strutturali.
- Supporta l'allineamento dei biomarcatori quando le conformazioni dipendenti dalla temperatura sono legate meccanicamente alla malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo estende il flusso di lavoro della criomicroscopia elettronica dalla preparazione standard a basse temperature a condizioni di alta temperatura, colmando il divario tra la fase iniziale della scoperta e la ricerca preclinica per bersagli termosensibili.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione e struttura delle proteine dipendenti dalla temperatura.
- Screening: Fornisce metriche quantitative e riproducibili sulla qualità delle griglie per analisi e imaging successivi.
- Analisi: Permette il confronto diretto degli stati strutturali in diverse condizioni di temperatura utilizzando i risultati della microscopia crioelettronica.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei dati strutturali con ambienti fisiologici o rilevanti per la patologia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per la preparazione di griglie ad alta temperatura su diversi bersagli proteici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi catturando conformazioni funzionalmente rilevanti.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione delle griglie ad alta temperatura per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate su prosegui/non prosegui riducendo l'ambiguità meccanicistica nei dati strutturali.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli asset basata sulla valutazione del rischio per caratteristiche strutturali dipendenti dalla temperatura.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione delle griglie per microscopia crioelettronica e nella manipolazione dei campioni a temperatura controllata.
- Richiede un apparato di vetrificazione specializzato, in grado di regolare con precisione temperatura e umidità.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la valutazione della qualità delle griglie e per i protocolli di acquisizione dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse classi di proteine o per intervalli di temperatura specifici di determinati organismi.
- Un controllo accurato del tempo e un'esecuzione rapida sono fondamentali per minimizzare gli artefatti da ghiaccio e garantire la riproducibilità.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Preparation of the Vitrification Apparatus
1:23
Warming Up the Sample and the Tools
1:49
Blotting Experiment
2:47
Quality Check for the Grids and Data Collection
3:40
Results: High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM
4:25
Conclusion
