Name: Un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per lanalisi delle interazioni ospite-microbiota (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Scopri un sistema di coltura di organi intestinali per analizzare le interazioni ospite-microbiota con controllo sperimentale e fisiologia preservata. Questo metodo combina vantaggi in vitro e in vivo per studiare le risposte intestinali.

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Ringraziamo i membri passati e presenti del laboratorio Yissachar per il loro prezioso contributo nell'ottimizzazione del protocollo del sistema di coltura degli organi intestinali. Ringraziamo Yael Laure per l'editing critico del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation (sovvenzione n. 3114831), dall'Israel Science Foundation - Broad Institute Joint Program (sovvenzione n. 8165162) e dal Gassner Fund for Medical Research, Israele.

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali approvate dal comitato etico per il benessere degli animali.
1. Preparazione dell'esperimento
<ol><li>Fabbricazione del dispositivo di coltura dell'organo intestinale (3 giorni)<ol>
<li>Utilizzando una stampante 3D, stampare gli stampi in plastica riutilizzabili per il dispositivo di coltura dell'organo (il dispositivo ha 6 pozzette, con 24 fori piccoli e grandi, e per il coperchio del coperchio del dispositivo) (file 3D allegati). NOTA: Questi stampi in plastica possono essere utilizzati per la fabbricazione di numerosi dispositivi.</li>
		<li>Inserire gli aghi smussati (22 G e 18 G) nella posizione appropriata all'interno dello stampo del dispositivo e gettare circa 20 g di miscela di polidimetilsilossano (PDMS) (rapporto peso 1:10, base al catalizzatore) per un set del dispositivo e coperchio.</li>
		<li>Posizionare gli stampi in una camera a vuoto per 30 minuti, per rimuovere le bolle d'aria dalla miscela PDMS.</li>
		<li>Incubare gli stampi a 55 °C durante la notte, per completare la polimerizzazione PDMS.</li>
		<li>Quando il PDMS è impostato, estrarre gli aghi dallo stampo e rilasciare con attenzione il dispositivo di coltura e il coperchio dagli stampi in plastica.</li>
		<li>Rimuovere i residui di PDMS dal contorno del pozzo utilizzando una lama chirurgica. Collegare il dispositivo PDMS e il coperchio del dispositivo su un vetro di copertura (micro vetrini da 75 mm x 50 mm) utilizzando adesivo siliconico non tossico e lasciare le parti da sistemare durante la notte (applicare la colla sul lato liscio del dispositivo).</li>
		<li>Inserire dodici aghi da 22 G per il lume e dodici aghi da 18 G per il pozzo. Fissare tutti gli aghi in posizione con silicone e lasciarlo impostare durante la notte. Inserire due aghi da 18 G nel coperchio di copertura per un corretto flusso d'aria dentro e fuori dal dispositivo di coltura degli organi intestinali.</li>
		<li>Controllare tutti gli aghi per le perdite utilizzando una siringa piena d'acqua. Controllare che non ci siano perdite dai pozzi riempiendo i pozzi con acqua.</li>
		<li>Posizionare due nodi chirurgici su ogni ago da 22 G che sarà collegato al colon. Posizionare il dispositivo e il coperchio in un sacchetto di carta per autoclave e sterilizzare in autoclave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Terreno di coltura (0,5 h)<ol>
<li>In una cappa biologica, mescolare quanto segue (in tubo da 50 ml): 37 mL di Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 mL di sostituzione del siero KSR, 1 mL di integratore B27, 0,5 mL di supplemento N2, 0,5 mL di tampone HEPES da 1 M e 0,5 mL di aminoacidi non essenziali.</li>
		<li>Filtrare e conservare il mezzo completo a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di tubi e strumenti chirurgici<ol>
<li>Tagliare la lunghezza appropriata dei tubi per il lumen di ingresso, il pozzo di ingresso, il lumen di uscita e il pozzo di uscita (12 tubi corti e 12 tubi lunghi). Collegare un adattatore appropriato a ciascun lato del tubo.</li>
		<li>Preparare gli strumenti chirurgici: forbici dritte, pinza sottile 4x e pinza affilata 2x.</li>
		<li>Posizionare i tubi e gli strumenti chirurgici in un sacchetto di carta per autoclave e sterilizzarli con un'autoclave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare l'input luminale (stimolazione desiderata - batteri, feci, farmaci, ecc.).<ol>
<li>Prima dell'esperimento, determinare la carica batterica della coltura batterica, mediante diluizioni seriali12,e la coltura in condizioni aerobiche e/o anaerobiche.</li>
		<li>Dopo aver calcolato la carica batterica, diluire le colture batteriche in terreno di coltura tissutale sterile per ottenere la concentrazione batterica richiesta. Per i campioni fecali, filtrare utilizzando un filtro da 100 μm. NOTA: Per la stimolazione non batterica (farmaci, metaboliti, ecc.), diluire la sostanza alla concentrazione richiesta utilizzando il terreno di coltura intestinale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione della configurazione dell'esperimento
<ol><li>All'interno dell'incubatore di colture d'organo, accendere l'unità di riscaldamento e impostarla a 37 °C.</li>
	<li>Impostare le pompe e le siringhe di ingresso e uscita.</li>
	<li>Input del terreno di coltura tissutale<ol>
<li>In una cappa a flusso biologico o laminare, riempire le siringhe del pozzo di ingresso con un terreno di coltura completo. Il volume finale dipende dalla durata dell'esperimento e dalla portata; di solito 1 mL/h più mezzo aggiuntivo per lo spurgo.</li>
		<li>Collegare i tubi alle siringhe utilizzando l'adattatore Luer-lock. Posizionare le siringhe riempite nelle pompe a siringa.</li>
		<li>Eliminare le siringhe di ingresso. Assicurarsi che il mezzo del pozzo fuoriesca da tutti i tubi in un vetro di scarto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ingresso luminale<ol>
<li>Riempire le siringhe di ingresso luminale con un trattamento di stimolazione (batteri, farmaci, ecc.). Il volume dipende dalla durata dell'esperimento e dalla portata (di solito 30 μL/h più mezzo aggiuntivo per lo spurgo).</li>
		<li>Collegare i tubi alle siringhe utilizzando l'adattatore Luer-lock. Posizionare le siringhe riempite nelle pompe a siringa.</li>
		<li>Eliminare le siringhe di ingresso. Assicurati che la stimolazione fluisca da tutti i tubi in un vetro di scarto. Fare attenzione a non contaminare le diverse stimolazioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uscite<ol>
<li>Posizionare le siringhe vuote nelle pompe a siringa di uscita (impostare la modalità pompa su "prelievo").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configurazione del dispositivo<ol>
<li>Impostare il regolatore che controlla la portata della miscela di gas (95% O2 + 5% CO2) per un flusso delicato e minimo.</li>
		<li>Esaminare il dispositivo in un cappuccio laminare.</li>
		<li>Lavare gli aghi del dispositivo con IMDM sterile per lavare gli aghi.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di terreno di coltura sterile in ciascun pozzo del dispositivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione per la dissezione dei tessuti<ol>
<li>Mettere gli strumenti chirurgici sterili all'interno del cappuccio laminare.</li>
		<li>Riempire una siringa da 10 ml con IMDM sterile e collegare un ago sterile (autoclavato) da 22 G per il lavaggio del colon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Colture d'organo
<ol><li>Sacrificio di topi e dissezione dei tessuti<ol>
<li>In un cappuccio laminare, sacrifica topi di 12-14 giorni per decapitazione. Spruzzare i topi con il 70% di etanolo e posizionare i topi su una piastra di plastica.</li>
		<li>Usando forbici affilate e pinza, seziona il topo ed estrai il tratto digestivo dallo stomaco all'ano tagliando tutto il grasso e i tessuti connettivi. Tagliare il colon e posizionarlo su un nuovo piatto. NOTA: Ridurre al minimo il contatto con il tessuto del colon. Non toccare la parte centrale del tessuto del colon. Tenere il tessuto delicatamente e solo ai bordi del tessuto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colon lavare e lavare<ol>
<li>Al microscopio di dissezione, lavare delicatamente il contenuto del colon con IMDM sterile (nel lato prossimale) con la siringa da 10 mL preparata (passo 2.7.2). Dopo aver rimosso le feci dal tessuto intestinale, posizionare il colon in una nuova piastra a 6 pozzetti riempita con 0,5 ml di IMDM sterile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collegamento dei due punti al dispositivo<ol>
<li>Prendi il tessuto e collegalo con cura all'ago da 22 G e fai una cravatta stretta con i due fili. A questo punto, è imperativo mantenere il corretto orientamento del colon al flusso lume (prossimale = ingresso, distale = uscita). Ripetere i passaggi 3.2-3.3 per tutti e 6 i tessuti.</li>
		<li>Verificare che le serrature Luer dell'ago di ingresso siano vuote dal supporto. In caso contrario, svuotarli. Aggiungere stimolazioni all'ago di ingresso Luer lock (per evitare l'ingresso di bolle d'aria nel lume). Ripeti questo passaggio per ogni colon con la stimolazione appropriata.</li>
		<li>Verificare che tutti i tessuti siano collegati e posizionare il coperchio di copertura sulla parte superiore del dispositivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collegamento del dispositivo di coltura dell'organo alle pompe<ol>
<li>Posizionare il dispositivo nella camera termoriscaldata preriscaldata (37 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collegare il flusso di gas<ol>
<li>Collegare l'adattatore del gas al coperchio di copertura utilizzando l'apposito ago di ingresso.</li>
		<li>Collegare i tubi di ingresso e uscita al dispositivo. NOTA: collegare il lato prossimale del colon alle vasche di ingresso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spurgare il lume con gli input di stimolazione.<ol>
<li>Far scorrere delicatamente la stimolazione luminale attraverso l'intestino e verificare il flusso medio nei tubi di uscita.</li>
		<li>Lavare il mezzo esterno.</li>
		<li>Lavare il mezzo esterno 3 volte (impostare le pompe ad una velocità di 600 μL/min sia per l'ingresso che per l'uscita). Ogni lavaggio richiede 1 minuto (iniziando svuotando il pozzo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avviare l'esperimento.<ol>
<li>Avviare le pompe alle seguenti velocità: Portata: lumen: ingresso- 30 μL/h, uscita- 35 μL/h Supporto esterno: ingresso- 1000 μL/h, uscita- 950 μL/h NOTA: il tempo dell'esperimento può variare da 30 minuti a 24 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fine dell'esperimento (fino a 24 ore per colture di organi del colon)<ol>
<li>Scollegare tutti i tubi dal dispositivo.</li>
		<li>Scollegare i tessuti dagli aghi e continuare con le lette desiderate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).</li>
<li>Pearce, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+in+vitro+and+ex+vivo+Models+to+Study+Host-Microbiome+Interactions+and+Acute+Stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors.</a> Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).</li>
<li>Hooper, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+commensal+host-microbial+relationships+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.</a> Science. 291 (5505), 881-884 (2001).</li>
<li>Haller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-pathogenic+bacteria+elicit+a+differential+cytokine+response+by+intestinal+epithelial+cell%2Fleucocyte+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures.</a> Gut. 47 (1), 79-87 (2000).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).</li>
<li>Gazzaniga, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+Colon+Chip+Technology+to+Identify+Commensal+Bacteria+That+Promote+Host+Tolerance+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).</li>
<li>Yissachar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intestinal+Organ+Culture+System+Uncovers+a+Role+for+the+Nervous+System+in+Microbe-Immune+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk.</a> Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).</li>
<li>Duscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propionic+Acid+Shapes+the+Multiple+Sclerosis+Disease+Course+by+an+Immunomodulatory+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism.</a> Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).</li>
<li>Grosheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screen+Identifies+Host+and+Microbiota+Regulators+of+Intestinal+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function.</a> Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).</li>
<li>Blaize, J. F., Corbo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intestinal+Th17+cells+by+segmented+filamentous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria.</a> Cell. 139 (3), 485-498 (2009).</li>
<li>Schnupf, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+host+interaction+of+mouse+segmented+filamentous+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro.</a> Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).</li>
<li>Chung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+immune+maturation+depends+on+colonization+with+a+host-specific+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota.</a> Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).</li>
<li>Atarashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+Cell+Induction+by+Adhesion+of+Microbes+to+Intestinal+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells.</a> Cell. 163 (2), 367-380 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo descrive un protocollo ottimizzato per le colture di organi intestinali ex vivo che Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato (pubblicato9 e dati non pubblicati). Il sistema di coltura degli organi intestinali supporta la coltura multiplexata di frammenti intestinali intatti mantenendo il flusso luminale. Fornisce il pieno controllo sull'ambiente intra ed extra-luminale (compresa la dose di stimolazione, il tempo di esposizione e la portata) e preserva la struttura na...

L'intestino è un organo altamente complesso contenente una vasta gamma di tipi di cellule (cellule epiteliali, cellule del sistema immunitario, neuroni e altro) organizzati in una particolare struttura che consente alle cellule di interagire e comunicare tra loro e con il contenuto luminale (microbiota, cibo, ecc.) 1. Attualmente, il toolbox di ricerca disponibile per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota comprende colture cellulari in vitro e modelli animali in vivo 2. I modelli animali in vivo forniscono una costruzione fisiologica del tessuto3 ma con scarso controllo sperimentale e limitata capacità di manipolare le condizioni dell'esperimento. I sistemi di coltura in vitro, d'altra parte, utilizzano cellule primarie o linee cellulari che possono essere integrate con microbi4, offrendo uno stretto controllo sui parametri dell'esperimento ma mancano della complessità cellulare e dell'architettura tissutale. I moderni saggi in vitro consentono l'uso avanzato di campioni di tessuto umano sani e patologici, come organoidi epiteliali derivati da fonti murine o umane5,6,e campioni che imitano il microambiente mucoso7. Un altro esempio è il test "gut on a chip", che include la linea cellulare epiteliale del colon umano (Caco2), la matrice extracellulare e i canali microfluidici per imitare la condizione fisiologica dell'invariante intestinale8. Tuttavia, per quanto avanzati e innovativi possano essere i campioni in vitro, non mantengono una normale architettura tissutale o una composizione cellulare ingenua.
Per affrontare questo problema, Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato un sistema di coltura di organi ex vivo 9 (Figura 1) che mantiene intatti i frammenti intestinali ex vivo, beneficiando dei vantaggi di modelli sia in vivo che in vitro. Questo sistema di coltura di organi intestinali ex vivo si basa su un dispositivo di coltura personalizzato che supporta una coltura multiplexata di sei tessuti del colon, consentendo di esaminare gli input sperimentali in condizioni comparabili controllando gli input e gli output del sistema. Lavori recenti hanno dimostrato che questo sistema è prezioso per analizzare le risposte intestinali ai singoli batteri intestinali9,campioni di microbiota umano intero10 e metaboliti microbici11. Questo sistema consente, per la prima volta, lo studio di queste prime interazioni ospite-microbiota con un alto livello di controllo sulle componenti ospiti, microbiche e ambientali. Inoltre, consente di monitorare e manipolare il sistema durante l'esperimento, in tempo reale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62779/62779fig01.jpg"> Figura 1: Schemi del dispositivo di coltura intestinale. Un intero frammento di tessuto intestinale è attaccato alle porte di uscita e di ingresso della camera (in alto), con pompe che regolano il flusso medio all'interno del lume e nella camera media esterna. L'intero dispositivo (in basso) contiene 6 di queste camere. Questa cifra è stata modificata da Yissachar et al. 2017. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62779/62779fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 Gauge Aghi smussati</td><td>Mcmaster</td><td>75165a754</td><td></td></tr><tr><td>22 gauge Aghi smussati</td><td>Mcmaster</td><td>75165a758</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo per tutti gli usi Selant 100% silicone</td><td>DAP</td><td>688</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore a vuoto cubico VDC-21+ 2 ripiani</td><td></td><td>AAAD4021</td><td></td></tr><tr><td>vetrino 1 mm di spessore</td><td>Corning</td><td>2947-75X50</td><td></td></tr><tr><td>Mini incubatrice im-10</td><td></td><td>AAH24315K</td><td></td></tr><tr><td>MPC 301E POMPA</td><td></td> per vuoto <td>VI-412711</td><td></td></tr><tr><td>Tappi di accoppiamento per tubo a rotazione rapida in plastica</td><td>Mcmaster</td><td>51525k121</td><td></td></tr><tr><td>Prese di accoppiamento per tubo a rotazione rapida in plastica</td><td>Mcmaster</td><td>52525k211</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomero siliconico</td><td>Dow</td><td></td><td>Polidimetilsilossano, PDMS</td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Mcmaster</td><td>6516t11</td><td></td></tr><tr><td>Zortrax M200</td><td>Zortrax</td><td></td><td>Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360</td></tr><tr><td>Zortrax M200 Materiali: z-ultrat</td><td>Zortrax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 Integratore (50x), Thermo Fisher</td><td>Scientific</td> <td>senza siero</td><td></td>17504044</tr><tr><td>HEPES Buffer (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium con rosso fenolo (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440061</td><td></td></tr><tr><td>Knock-Out Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1370701</td><td></td></tr><tr><td>Non Aminoacido essenziale (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici grandi</td><td>Aseltech</td><td>11-00-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze affilate</td><td>FST</td><td>11297-10</td><td></td></tr><tr><td>Filo chirurgico intrecciato in seta</td><td>SMI</td><td>8010G</td><td></td></tr><tr><td>Forbici dritte</td><td>FST</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinze sottili</td><td>F.S.T</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Organ System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &micro; m</td><td>Filtro Life Gene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filter</td><td>Life Gene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer Lock Siringa</td><td>B-D</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>Greenough Stereomicroscopio</td><td>ZEISS</td><td>Stemi 305</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore d'aria di precisione a ricircolo "CUBE"CUBE"</td><td></td><td>CUBE-2-LIS</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>New Era Pump Systems inc</td><td>nep-ne-1600-em</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

La struttura del tessuto intestinale facilita le interazioni strette e mutualistiche tra l'ospite e il microbiota intestinale. Questi colloqui incrociati sono cruciali per mantenere l'omeostasi locale e sistemica; le modifiche alla composizione del microbiota intestinale (disbiosi) si associano a una vasta gamma di malattie umane. I metodi per sezionare le interazioni ospite-microbiota comprendono un compromesso intrinseco tra la conservazione della struttura fisiologica dei tessuti (quando si utilizzano modelli animali in vivo) e il livello di controllo sui fattori dell'esperimento (come nei semplici sistemi di coltura cellulare in vitro). Per affrontare questo compromesso, Yissachar et al. hanno recentemente sviluppato un sistema di coltura di organi intestinali. Il sistema preserva una costruzione naïf del tessuto del colon e meccanismi cellulari e consente anche uno stretto controllo sperimentale, facilitando sperimentazioni che non possono essere prontamente eseguite in vivo. È ottimale per sezionare le risposte a breve termine di vari componenti intestinali (come elementi epiteliali, immunologici e neuronali) a perturbazioni luminali (inclusi microbi anaerobici o aerobici, campioni interi di microbiota di topi o esseri umani, farmaci e metaboliti). Qui, presentiamo una descrizione dettagliata di un protocollo ottimizzato per la coltura di organi di più frammenti intestinali utilizzando un dispositivo di coltura intestinale personalizzato. Le risposte dell'ospite alle perturbazioni luminali possono essere visualizzate mediante colorazione immunofluorescenza di sezioni di tessuto o frammenti di tessuto a montaggio intero, ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) o imaging time-lapse. Questo sistema supporta una vasta gamma di lettura, tra cui il sequenziamento di nuova generazione, la citometria a flusso e vari saggi cellulari e biochimici. Nel complesso, questo sistema di coltura di organi tridimensionali supporta la coltura di tessuti intestinali grandi e intatti e ha ampie applicazioni per l'analisi ad alta risoluzione e la visualizzazione delle interazioni ospite-microbiota nell'ambiente intestinale locale.

Il sistema di coltura degli organi intestinali mantiene la vitalità dei tessuti ex vivo. La valutazione della vitalità dei tessuti è stata effettuata durante tutto il periodo di coltura. I frammenti di tessuto del colon sono stati incubati nel sistema di coltura degli organi intestinali e fissati dopo la coltura di 2/12/24 ore. L'integrità dello strato di cellule epiteliali intestinali (IEC) è stata convalidata mediante colorazione immunofluorescenza utilizzando anticorpi E-caderina e citocheratina-18. Allo ste...

Questo articolo presenta un metodo unico per analizzare le interazioni ospite-microbioma utilizzando un nuovo sistema di coltura di organi intestinali per esperimenti ex vivo.

Un sistema di coltura di organi intestinali intestinali per l'analisi delle interazioni ospite-microbiota

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Il sistema di coltura degli organi intestinali combina i vantaggi dei saggi in vitro e in vivo e funge quindi da fase sperimentale intermedia tra semplici saggi in vitro a complessi esperimenti in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la combinazione di uno stretto controllo sperimentale con la conservazione della fisiologia intestinale. Questo metodo fornisce informazioni per analizzare le risposte intestinali a stimoli specifici con un alto livello di controllo sui componenti ospiti, microbici e ambientali.A dimostrare la procedura saranno Alon Shemesh, uno studente di Master del mio laboratorio, e il Dr.Sivan Amidror, il nostro responsabile di laboratorio. Per iniziare, inserire gli aghi smussati nella posizione appropriata all'interno dello stampo del dispositivo e gettare circa 20 grammi di polidimetilsilossano o miscela PDMS, per un set del dispositivo e del coperchio. Posizionare gli stampi in una camera a vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria dalla miscela PDMS, quindi incubare gli stampi a 55 gradi Celsius durante la notte per completare la polimerizzazione PDMS.Quando il PDMS è impostato, estrarre gli aghi dallo stampo e rilasciare con attenzione il dispositivo di coltura e il coperchio dagli stampi in plastica. Rimuovere i residui di PDMS dal contorno del pozzo utilizzando una lama chirurgica. Collegare il dispositivo PDMS e il coperchio del dispositivo su un vetro di copertura di microslidi da 75 per 50 millimetri utilizzando adesivo siliconico non tossico e lasciare che le parti si insertino durante la notte.Applicare l'incollato sul lato liscio del dispositivo. Inserire 12, 22 aghi di calibro per il lume e 12, 18 aghi di calibro per il pozzo. Fissare tutti gli aghi in posizione con silicone e lasciarlo impostare durante la notte.Spurgare le siringhe in ingresso e assicurarsi che il mezzo del pozzo fuoriesca da tutti i tubi in un vetro di scarto, quindi spurgare le siringhe in ingresso e assicurarsi che le stimolazioni fluiscano da tutti i tubi in un vetro di scarto, facendo attenzione a non contaminare le diverse stimolazioni. Dopo aver sacrificato il topo, usa forbici affilate e pinza per sezionarlo ed estrai il tratto digestivo dallo stomaco all'ano, tagliando tutto il grasso e i tessuti connettivi. Tagliare il colon e posizionarlo su un nuovo piatto.Ridurre al minimo il contatto tenendo il tessuto delicatamente e solo ai bordi. Eseguire il lavaggio del colon al microscopio di dissezione. Lavare delicatamente il contenuto del colon con IMDM sterile con la siringa da 10 millilitro preparata come descritto nel testo.Dopo aver rimosso le feci dal tessuto intestinale, posizionare il colon in una nuova piastra a sei pozzetti riempita con 0,5 millilitri di IMDM sterile. Quindi, prendi il tessuto del colon e collegalo con attenzione all'ago calibro 22, facendo una cravatta stretta con i due fili. Mantenere il corretto orientamento del colon al flusso lumen, in modo tale che il prossimale e il distale siano uguali rispettivamente all'ingresso e all'uscita.Ripetere il lavaggio del colon e legare l'ago per tutti i tessuti. Collegare i tubi di ingresso e uscita al dispositivo, quindi iniziare l'esperimento avviando le pompe alle velocità desiderate. Sono state rilevate cellule calicio piene di muco nell'epitelio del colon e la secrezione di muco all'interno del lume e la proliferazione iec nelle cripte del colon, come indicato dalla colorazione KI67.Questi risultati hanno mostrato che il sistema di coltura intestinale mantiene la funzione e la struttura intestinale ex-vivo. Dopo due ore di introduzione di batteri filamentosi segmentati, o SFB, i tipici filamenti SFB sono stati rilevati in stretta associazione con i villi dell'intestino tenue utilizzando l'ibridazione fluorescente in situ. Inoltre, una microscopia elettronica a trasmissione ha presentato SFB entro pochi micron dal bordo del pennello dell'epitelio dell'intestino tenue.I profili di espressione genica di campioni di tessuto intero sono stati prodotti in triplice copia due ore dopo l'infusione con SFB. Le colture di controllo sono state infuse con sospensioni fecali di topi monocolonizzati privi di germi o Bacteroides fragilis. Questi cambiamenti persuasi da SFB erano principalmente di piccola ampiezza rispetto al controllo privo di germi.L'orientamento del colon è molto importante. Prestare particolare attenzione quando si lega il colon sull'ago. Una corretta cravatta impedirà la contaminazione del pozzo con il contenuto di lumen.Una vasta gamma di tecniche di lettura può seguire questo protocollo, come il sequenziamento di nuova generazione, l'imaging, l'ordinamento cellulare e molti altri. Queste leggi forniscono nuove informazioni sulle interazioni del microbioma dell'ospite in salute e malattia.

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Immunology and Infection

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