Name: Trasduzione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Scopri la trasduzione transitoria rapida di Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. Questa tecnica avanzata facilita la ricerca genetica sul parassita cestode per comprendere meglio la patogenesi dell'echinococcosi cistica.

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La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Elite Researcher Grant Committee con il numero di premio 958680 del National Institute for Medical Research Development (NIMAD), Teheran, Iran.

Questo studio è stato approvato dal National Institute for Medical Research Development e dal Research Ethics Review Committee, n. 958680. I lentivirus sono classificati come organismi BSL-2; quindi, tutte le procedure di coltura di laboratorio in questo protocollo sono state eseguite utilizzando pratiche di laboratorio sterili e condotte sotto una cappa a flusso laminare secondo le linee guida NIH. La Figura 1 mostra una presentazione schematica del protocollo di studio per i diversi stadi di E. granulosus .
1. Raccolta di cisti idatidi
<ol><li>Raccogli cisti idatidi epatiche da pecore naturalmente infette macellate regolarmente in un mattatoio.</li>
	<li>Sterilizzare completamente la superficie della cisti utilizzando una garza sterile e alcool al 70% prima di aspirare i protoscoleces (PSC).</li>
	<li>Aspirare 20-50 mL di liquido idatidico in tubi conici sterili da 50 mL.</li>
	<li>Dopo il drenaggio, asciugare la cisti con una lama affilata, trasferire lo strato germinale in un tubo conico sterile da 50 ml e agitarlo per un breve periodo (~ 2 min) per aumentare la raccolta di PSC. Trasferire lo strato germinale in un nuovo tubo da 1,5 ml per la caratterizzazione molecolare.</li>
	<li>Lavare i PSC 3-5x con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Osservare i PSC in eosina allo 0,1% per 5 minuti per determinare la vitalità del PSC al microscopio ottico. Utilizzare PSC con almeno il 95% di vitalità per la cultura.</li>
	<li>Trattare il precipitato PSC con 2 mL di pepsina (2 mg/mL, pH 2) per 15-20 min.</li>
	<li>Per isolare i singoli PSC, risospese il sedimento PSC in PBS e passarlo attraverso due strati di garza sterile in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml. NOTA: Calcolare la media di tre conteggi su 50 μL di sedimenti PSC utilizzando un microscopio ottico. Per le prove successive, utilizzare il valore stimato per determinare le PSC/μL. Ogni isolato di cisti idatidica deve essere caratterizzato sulla base di polimorfismi nucleotidici mediante metodi molecolari, come il sequenziamento PCR17 o l'analisi della curva di fusione ad alta risoluzione18.</li>
</ol>2. Coltivazione bifasica di PSC di E. granulosus per ottenere vermi adulti
NOTA: le PSC isolate devono essere coltivate in condizioni sterili in un armadio a flusso laminare di classe II. Preparare separatamente le fasi solida e liquida del terreno di coltura bifasico prima di procedere ai passaggi successivi19.
<ol><li>Preparare il terreno di coltura bifasico in modo che consista in due fasi.<ol>
<li>
Per la fase solida, aggiungere 10 mL di siero bovino in un matraccio da 25 mL e lasciarlo coagulare a 76 °C per 20-30 min.</li>
		<li>
Per la fase liquida (CMRL modificata), mescolare 100 mL di siero fetale di vitello inattivato dal calore (FCS), 36 mL di estratto di lievito al 5%, 5,6 mL di glucosio al 30% (in acqua distillata), 1,4 mL di bile di cane al 5% in PBS, tampone HEPES da 20 mM e 10 mM NaHCO3 in 260 mL di mezzo CMRL-1066. Infine, aggiungere penicillina (100 UI / mL) e streptomicina (100 mg / mL) alla miscela.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 10 mL del mezzo di fase liquida a ciascun pallone di coltura di 25 cm2 .</li>
	<li>Aggiungere circa 5.000 PSC al matraccio di coltura e trasferire il matraccio all'incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Dopo 24-48 ore, trasferire gli sportelli unici in un nuovo matraccio con la fase solida (siero bovino) e aggiungere 1 mL dello stesso mezzo di fase liquido fresco per matraccio. Trasferire i palloni nell'incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Ogni 5-7 giorni, sostituire il mezzo con un mezzo di fase liquido fresco in base ai cambiamenti nel colore del terreno di coltura e alla proporzione stimata di PSC differenziati. NOTA: Le protoscoleces rispondono rapidamente ai cambiamenti ambientali dopo essere state coltivate e la maggior parte di esse subisce la differenziazione entro 2-3 settimane. A causa del consumo di sostanze nutritive e della crescita e dello sviluppo dei protoscoleces, il pH del terreno di coltura cambia e il suo colore si sposta verso l'arancione e il giallo.</li>
</ol>3. Coltivazione monofasica di PSC di E. granulosus
<ol><li>Assicurarsi che la coltivazione monofasica sia fatta 24-48 ore prima della trasduzione.<ol>
<li>Coltura ~ 5.000 PSC in un matraccio di colturadi 25 cm 2 con RPMI e siero bovino fetale al 10% (FBS).</li>
		<li>Trasferire i palloni nell'incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2) fino all'uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Coltura cellulare per la produzione e la preparazione del virus
NOTA: Le cellule del rene embrionale umano 293T (HEK293T) sono state ottenute per la produzione di vettori dal Pathology and Stem Cell Research Center, Kerman University of Medical Sciences.
<ol><li>Trasferire 5 × 105 cellule HEK293T in un matraccio da25 cm 2 contenente 5 mL di DMEM con il 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.</li>
	<li>Incubare le cellule HEK293T a 37 °C in 5% di CO2 e passarle nel terreno di coltura completo ogni 48 ore. Infine, utilizzare celle HEK293T a passaggio basso per la trasduzione20.</li>
</ol>5. Produzione e preparazione del virus con i vettori lentivirali di terza generazione
NOTA: Il vettore di lentivirus pCDH513b (vettore di trasferimento) e PLPII, PLPI e PMD2G (vettori helper) sono stati utilizzati per esprimere il gene reporter GFP. Vedere la tabella dei materiali e la figura supplementare S1.
<ol><li>Giorno 1:<ol>
<li>Dopo aver tripsinato le cellule HEK293T21 in piastre di coltura a 6 pozzetti, il seme 7 × 104 cellule per pozzetto con DMEM fresco privo di antibiotici contenente il 10% di FBS.
</li>
		<li>Utilizzare cellule con una confluenza del 50%-60% per la trasduzione con il metodo del fosfato di calcio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 2:<ol>
<li>Sostituire il terreno di coltura cellulare 2-3 ore prima dell'esperimento con DMEM fresco privo di antibiotici contenente il 2% di FBS.</li>
		<li>In un tubo da 1,5 mL, mescolare i plasmidi lentivirali di terza generazione, tra cui 7 μg/μL pCDH513b (vettore di trasferimento), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI e 2 μg/μL PMD2G (vettori helper).</li>
		<li>Aggiungere il tampone HEPES (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES e 1,5 mM Na2HPO4; intervallo di pH ottimale, 7,00-7,28) alla miscela per un volume di 422 μL.</li>
		<li>Aggiungere 16 μL di tampone Tris-EDTA (TE) all'1% alla miscela.</li>
		<li>Aggiungere 62 μL di cloruro di calcio da 2,5 mM ai tubi e mescolare bene.</li>
		<li>Aggiungere 500 μL di 2x soluzione salina tamponata con HEPES (HBS) alla miscela, goccia a goccia, entro 1-2 minuti utilizzando una pipetta Pasteur. Mescolare delicatamente fino ad ottenere una soluzione semi-opaca e incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere lentamente il composto a ciascun piatto e distribuirlo con lenti movimenti circolari.</li>
		<li>Incubare le piastre a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5% e sostituire il mezzo dopo 4-6 ore con DMEM privo di antibiotici contenente il 10% di FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 3:<ol>
<li>Confermare la trasduzione transitoria e la vitalità cellulare di successo utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 4:<ol>
<li>Raccogliere i virus dal terreno di coltura raccogliendo il surnatante di ciascun pozzo e conservarli a -70 °C fino all'uso. NOTA: I lentivirus raccolti potrebbero essere concentrati e titolati per una trasfezione precisa22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Trasduzione transitoria di diversi stadi di E. granulosus con il virus
<ol><li>Giorno 1:<ol>
<li>Utilizzare una piastra di coltura a 12 pozzetti per il trasferimento genico. Coltura 5 × 103-5 × 104 celle HEK293T in triplice copia, con mezzo DMEM completo come riferimento interno.</li>
		<li>Cultura 150 PSC freschi in triplice copia in RPMI e 10% FBS.</li>
		<li>Coltura 30 vermi strobilati in triplice copia in DMEM contenente il 10% di FBS inattivato dal calore. NOTA: tutti i mezzi di trasduzione devono essere privi di antibiotici. Mantenere tre pozzi di controllo non trattati per celle HEK293T, PSC e vermi strobilati nel processo.</li>
		<li>Preparare una miscela di 1 × 106 virus con reagente di trasfezione da 4 μg/mL (vedere la Tabella dei materiali) per trasdurre le cellule HEK293T e le diverse fasi del worm.</li>
		<li>Aggiungere lentamente il composto a ciascun piatto e distribuirlo con lenti movimenti circolari. Incubare le piastre per 4-6 ore in un incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2). Sostituire il mezzo per ciascun campione con lo stesso terreno di coltura completo per ridurre al minimo gli effetti tossici del reagente di trasfezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 2:<ol>
<li>Ripetere i passaggi 6.1.4-6.1.5 per aumentare l'efficienza della trasduzione transitoria per le celle HEK293T, i PSC e i vermi strobilati.</li>
		<li>Incubare tutte le piastre per 24-48 ore in un incubatore a CO2 con le stesse condizioni di coltura in base al tipo di mezzo cellulare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorno 3:<ol>
<li>Verificare se la trasduzione ha successo utilizzando la microscopia a fluorescenza. NOTA: Prendere in considerazione l'utilizzo di ulteriori test di conferma come PCR / qPCR20,23 o Western blotting24 tecniche nella procedura di trasferimento genico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Comprendere le basi molecolari dei nematodi e la biologia di Platyhelminthes è fondamentale per comprendere la patogenicità dei parassiti zoonotici27. La mancanza di un efficace sistema di valutazione genica è un grosso ostacolo all'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, tra cui la specie Echinococcus 12,27. Il presente studio dimostra l'eccellente potenziale del lentivirus nella trasduzione t...

L'echinococcosi cistica (CE) è una delle più importanti malattie da elminti causata da Echinococcus granulosus, una piccola tenia della famiglia Taeniidae 1,2. Sono stati condotti studi approfonditi sullo sviluppo immunodiagnostico e vaccinale per E. granulosus. Tuttavia, una conoscenza inadeguata delle basi molecolari della biologia dei parassiti pone importanti limitazioni nella diagnosi, gestione e prevenzione della malattia idatide 3,4,5,6.
Negli ultimi anni, a causa dello sviluppo del sequenziamento del genoma e dei metodi trascrittomici, una vasta gamma di studi molecolari è stata condotta sui platelminti da diversi gruppi di ricerca 7,8,9. Tuttavia, nel mondo dei parassiti, i progressi nella tecnologia di trasferimento genico nei vermi piatti parassiti sono ancora limitati rispetto ai metodi di trasduzione transitoria altamente riproducibili sviluppati per alcuni protozoi 10,11,12.
L'uso di sistemi di consegna virale è emerso come uno strumento essenziale per la consegna transgenica e le indagini geniche / proteiche negli ultimi due decenni13. Il lentivirus infetta sia le cellule in divisione che quelle non in divisione, rendendo così possibile infettare le cellule postmitotiche 14,15,16. Prove recenti indicano che l'utilizzo di un sistema di trasduzione basato su lentivirus nelle cellule di mammifero offre il potenziale per superare la maggior parte dei limiti delle precedenti tecniche di knock-in / knock-down. La progettazione e la costruzione di vettori lentivirali di espressione con marcatori molecolari appropriati, come l'espressione GFP, sono stati descritti in precedenza16. Pertanto, valutiamo la trasduzione transitoria lentivirale di un gene reporter GFP nei protoscoleces e nei vermi strobilati di E. granulosus.

<table><tbody><tr><td>piastre di coltura a 12 pozzetti</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30012</td><td></td></tr><tr><td>pallone di coltura da 25 cm2</td><td>SPL Life Sciences</td><td>70325</td><td></td></tr><tr><td>piastre di coltura a 6 pozzetti</td><td>SPL Life Sciences</td><td>30006</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-500G</td><td>Concentrazione di lavoro: 2,5&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CMRL 1066 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11530037</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>memmert</td><td>ICO150</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technology</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Bile</td><td></td><td></td> di cane <td>Isolato da un cane soppresso e sterilizzato da 0,2 &mu; m filtro siringa</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009-5G</td><td>preparare lo 0,1% di Eosina per il test di esclusione</td></tr><tr><td>funzionante Siero fetale bovino (FBS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9723-100ml</td><td>Inattivazione del calore&nbsp; di&nbsp; FBS (30 min in 40 &deg; C)</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9724-100ml</td><td>Inattivazione termica&nbsp; di&nbsp; FCS (30 min in 40 &deg; C)</td></tr><tr><td>HEK293T cellule</td><td>BONbiotech</td><td>BN_0012.1.14</td><td>Rene embrionale umano 293T</td></tr><tr><td>HEPES soluzione salina tamponata (HBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558-50ML</td><td>2x concentrato</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertita</td><td>OLYMPUS</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-10MU</td><td>Concentrazione di lavoro: 100 UI/mL</td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Roche</td><td>10108057001</td><td>Concentrazione di lavoro: 2 mg/mL, pH 2</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB0011</td><td>Questo reagente si risolve in meno di 1 minuto in D.W</td></tr><tr><td>Polybrene (reagente di trasfezione)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>BioIdea</td><td>BI-1006-05</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137-25G</td><td>Concentrazione di lavoro: 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Plasmide lentivirale di terza generazione (pCDH513b)</td><td>SBI System Biosciences (BioCat GmbH)</td><td>CD513B-1-SBI</td><td>Vettore di trasferimento (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Istruzione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran)</td></tr><tr><td>Plasmide lentivirale di terza generazione (pLPI e pLPII)</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>K4975-00</td><td>Vettore helper (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Educazione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran)</td></tr><tr><td>Plasmide lentivirale di terza generazione (pMD2G)</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 12259</td><td>Vettore helper (ottenuto commercialmente dal Dipartimento di Ricerca di Medicina Molecolare del Centro Accademico Iraniano per l'Istruzione, la Cultura e la Ricerca (ACECR), Mashhad, Iran)</td></tr><tr><td>Tris/EDTA Buffer (TE)</td><td>DNAbiotech</td><td>DB9713-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9935-50MG</td><td>1x soluzioni di lavoro (pH 7,4&ndash; 7.6)</td></tr></tbody></table>

trasduzione transitoria delle forme strobilate di echinococcus granulosus

Transient Transduction of the Strobilated Forms of Echinococcus granulosus

L'echinococcosi cistica o malattia idatide è una delle più importanti malattie parassitarie zoonotiche causate da Echinococcus granulosus, una piccola tenia ospitata nell'intestino dei canini. C'è un urgente bisogno di ricerca genetica applicata per comprendere i meccanismi di patogenesi e controllo e prevenzione delle malattie. Tuttavia, la mancanza di un efficace sistema di valutazione genica impedisce l'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, compresa la specie Echinococcus . Il presente studio dimostra il potenziale della trasduzione transitoria del gene lentivirale nelle forme metacestolodiche e strobilate di E. granulosus. I protoscoleces (PSC) sono stati isolati dalle cisti idatide e trasferiti in specifici terreni di coltura bifasici per svilupparsi in vermi strobilati. I vermi sono stati trasfettati con lentivirus di terza generazione raccolti, insieme a cellule HEK293T come controllo del processo di trasduzione. Una fluorescenza pronunciata è stata rilevata nei vermi strobilati per 24 ore e 48 ore, indicando una trasduzione lentivirale transitoria in E. granulosus. Questo lavoro presenta il primo tentativo di trasduzione transitoria basata sul lentivirus nelle tenie e dimostra i risultati promettenti con potenziali implicazioni negli studi sperimentali sulla biologia dei vermi piatti.

Qui, descriviamo una tecnica di trasduzione transitoria rapida ed efficiente in E. granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. Abbiamo coltivato PSC in un terreno di coltura bifasico per ottenere vermi strobilati, come descritto in precedenza25,26. I protoscoleces si sviluppano in vermi strobilati dopo 6 settimane in vitro. Diversi stadi di E. granulosus sono stati osservati nel terreno di coltura bifasico, tra cui ...

Descriviamo una tecnica di trasduzione rapida transitoria in diversi stadi di sviluppo di Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione.

Trasduzione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus

Cystic echinococcosis or hydatid disease is one of the most important zoonotic parasitic diseases caused by Echinococcus granulosus, a small tapeworm ...

Transazione transitoria delle forme strobilate di Echinococcus granulosus. Descriviamo una tecnica di trasduzione rapida transitoria in diversi stadi di sviluppo di Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. L'echinococcosi cistica o malattia idatide è una delle più importanti malattie parassitarie zoonotiche causate da Echinococcus granulosus, una piccola tenia ospitata nell'intestino dei canini.C'è un urgente bisogno di ricerca genetica applicata per comprendere i meccanismi di patogenesi e controllo e prevenzione delle malattie. Tuttavia, la mancanza di un efficace sistema di valutazione genica impedisce l'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, comprese le specie di Echinococcus. I progressi nel trasferimento genico nei platelminti parassiti sono ancora limitati rispetto al parassita protozoo.L'uso del sistema di consegna virale è emerso come uno strumento essenziale per la consegna transgenica e l'indagine genica / proteica negli ultimi due decenni. Quindi abbiamo valutato la trasduzione transitoria lentivirale del gene reporter GFP ai protoscoleces e ai vermi strobilati di Echinococcus granulosus. La Figura 1 mostra una presentazione schematica del protocollo di studio per gli stadi di Echinococcus granulosus.Uno, raccogliendo cisti idatide. Raccogli cisti idatidi epatiche da pecore naturalmente infette macellate regolarmente in un mattatoio. Sterilizzare completamente la superficie della cisti utilizzando una garza sterile e alcool al 70% prima di aspirare i protoscoleces.Aspirare da 20 a 50 mL di liquido idatidico in tubi conici sterili da 50 mL. Dopo il drenaggio, asciugare la cisti con una lama affilata, trasferire lo strato germinale in un tubo conico sterile da 50 ml e scuoterlo per un breve periodo per aumentare la raccolta di protoscoleces. Lavare i protoscoleces con tampone PBS da tre a cinque volte.Osservare le protoscoleces in 0,1% di eosina per cinque minuti per determinare la vitalità delle protoscoleces al microscopio ottico. Utilizzare protoscoleces con almeno il 95% di vitalità per la cultura. Trattare i protoscoleces precipitare con due ml di pepsina per 15-20 minuti.Per isolare le singole protoscoleces, risospesso il sedimento protoscoleces in PBS e passarlo attraverso due strati di garza sterile in un nuovo tubo conico sterile da 50 ml. Due, coltivazione bifasica di protoscoleces di Echinococcus granulosus per ottenere vermi adulti. Aggiungere 10 ml del mezzo di fase liquida a ciascun pallone di coltura quadrato di 25 centimetri.Aggiungere circa 5.000 protoscoleces al pallone di coltura e trasferirlo all'incubatore a CO2. Dopo 24-48 ore, trasferire i protoscoleces in un nuovo matraccio con la fase solida e aggiungere un mL dello stesso mezzo di fase liquida fresca per pallone. Trasferire i palloni nell'incubatore, 37 gradi Celsius, 5% CO2.Ogni cinque o sette giorni, sostituire il mezzo con un mezzo di fase liquido fresco. Tre, coltivazione monofasica di protoscoleces di un Echinococcus granulosus. Assicurarsi che la coltivazione monofasica sia effettuata da 24 a 48 ore prima della trasduzione.Coltura circa 5.000 protoscoleces in un pallone di coltura quadrato di 25 centimetri con RPMI e 10% FBS. Trasferire i palloni nell'incubatore a CO2 fino all'uso. Quattro, coltura cellulare per la produzione e la preparazione del virus.Trasferire 500.000 cellule HEK in un pallone quadrato di 25 centimetri contenente 5 ml di DMEM con 10% FBS, 100 U / mL di penicillina e 100 microgrammi / mL di streptomicina. Incubare le cellule HEK2 a 37 gradi Celsius nel 5% di CO2 e passarle nel terreno di coltura completo ogni 48 ore. Infine utilizzare celle HEK a basso passaggio per la trasduzione.Cinque, produzione e preparazione del virus con i vettori lentivirali di terza generazione. Il primo giorno, dopo aver tripsinato le cellule HEK in piastre di coltura a 6 pozzetti, semina 70.000 cellule per pozzo con DMEM fresco privo di antibiotici contenente il 10% di FBS. Utilizzare cellule con una confluenza compresa tra il 50 e il 60% per la trasduzione con il metodo del fosfato di calcio.Secondo giorno, sostituire il terreno di coltura cellulare due o tre ore prima dell'esperimento con DMEM fresco privo di antibiotici contenente il 2% di FBS. In un tubo da 1,5 mL, mescolare plasmidi lentivirali di terza generazione, tra cui 7 microgrammi / microlitro pCDH513b vettore di trasferimento, 4 microgrammi / microlitro PLPII, 4 microgrammi / microlitro PLPI e 2 microgrammi / microlitro PMD2G vettori helper. Aggiungere il tampone HEPES alla miscela per raggiungere il volume di 422 microlitri.Aggiungere 16 microlitri di tampone 1%TE alla miscela. Aggiungere 62 microlitri di 2,5 ml di cloruro di calcio ai tubi e mescolare bene. Aggiungere 500 microlitri di 2x tampone HBS alla miscela, goccia a goccia entro uno o due minuti usando una pipetta Pasteur.Mescolare delicatamente fino ad ottenere una soluzione semi-opaca e incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente. Alla fine, aggiungere lentamente la miscela a ciascun piatto e distribuirla con lenti movimenti circolari. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 al 5% e sostituire il mezzo dopo quattro-sei ore con DMEM privo di antibiotici contenente il 10% di FBS.Terzo giorno, confermare il successo della trasduzione transitoria e della vitalità cellulare utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita. Quarto giorno, raccogliere i virus dal terreno di coltura raccogliendo il surnatante di ciascun pozzo e conservarli a 70 gradi Celsius negativi fino all'uso. Sei, trasduzione transitoria di diversi stadi di Echinococcus granulosus con il virus.Il primo giorno, utilizzare una piastra di coltura a 12 pozzetti per il trasferimento genico. Coltura da 5.000 a 50.000 cellule HEK in triplicati con un mezzo DMEM completo come riferimento interno. Coltura 150 protoscoleces fresche in triplicati in RPMI e 10%FBS.Coltura 30 vermi strobilati in triplice copia in DMEM e FBS inattivato al calore al 10%. Preparare una miscela di 1 milione di virus con quattro microgrammi/mL di reagente di trasfezione per trasdurre le cellule HEK e le diverse fasi del worm. Aggiungere lentamente il composto a ciascun piatto e distribuirlo con lenti movimenti circolari.Incubare le piastre per quattro-sei ore in un incubatore a CO2, 37 gradi Celsius, 5% CO2. Sostituire il mezzo per ciascun campione con lo stesso terreno di coltura completo per ridurre al minimo gli effetti tossici dei reagenti di trasfezione. Secondo giorno, ripetere due passaggi precedenti per aumentare l'efficienza della trasduzione transitoria per le cellule HEK, protoscoleces e vermi strobilati.Incubare tutte le piastre per 24-48 ore in un incubatore a CO2 con le stesse condizioni di coltura in base al tipo di mezzo cellulare. Terzo giorno, assicurarsi che la trasduzione abbia successo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Risultati rappresentativi.Qui descriviamo una tecnica di trasduzione transitoria rapida ed efficiente in Echinococcus granulosus utilizzando vettori lentivirali di terza generazione. Abbiamo coltivato protoscoleces in terreni di coltura bifasici per ottenere vermi strobilati secondo i nostri studi precedenti. I protoscoleces vengono sviluppati nei vermi strobilati dopo una coltura in vitro di sei settimane.Diversi stadi di Echinococcus granulosus sono stati osservati nel terreno di coltura bifasico, tra cui protoscoleces invaginati, Figura 2A, protoscoleces evaginate, Figura 2B e vermi strobilati con prima e terza formazione progglottide, Figura 2C attraverso E.Protoscoleces e i vermi strobilati ottenuti da coltivazioni monofasiche e bifasiche, rispettivamente, sono stati trasfettati da lentivirus che esprimono GFP, Figura 3. Le celle HEK hanno chiaramente espresso GFP come controllo del processo di trasduzione transitoria. I vermi adulti esprimevano GFP più distintamente nello strato tegumentale.Tuttavia, i protoscoleces hanno dimostrato un livello leggermente inferiore di espressione della GFP dopo 48 ore. Alcuni residui di fluido cisti e/o detriti dello strato germinale intorno ai protoscoleces hanno causato un fondo di fluorescenza nei campioni trasfettati. L'intensità della fluorescenza nelle cellule HEK e nei vermi strobilati è aumentata dopo 24 e 48 ore.Comprendere le basi molecolari dei nematodi e la biologia di Platyhelminthes è una delle frontiere più importanti nella patogenicità dei parassiti zoonotici. La mancanza di un efficace sistema di valutazione genica è un grosso ostacolo all'interpretazione diretta della genetica funzionale dei parassiti cestodi, comprese le specie di Echinococcus. L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di illustrare il processo di trasduzione del vettore lentivirale che sarà fondamentale nella futura ricerca sull'echinococcosi.I risultati mostrano che i vermi strobilati sono più sensibili alla trasduzione transitoria del gene rispetto ai protoscoleces, che possono essere il risultato di un'estesa struttura tegumentale nelle forme strobilate. Tuttavia, a causa della natura della trasduzione lentivirale, l'intensità di fluorescenza nei protoscoleces multicellulari e nei vermi strobilati è in genere molto inferiore rispetto alle cellule HEK monostrato. C'è un urgente bisogno di ricerca genetica applicata a livello genomico e trascrittomico per Echinococcus, nonché un'ampia varietà di sistemi modello di vermi piatti parassiti e liberi.Pertanto, lo sviluppo del processo di trasferimento genico alle tenie apre la strada a un potenziale utilizzo delle nuove tecniche come la mappatura genica basata su virus o l'editing genetico mediato da CRISPR-Cas9. Questo lavoro presenta la trasduzione lentivirale in un modello di tenia e dimostra risultati promettenti con potenziali implicazioni per la biologia dei vermi piatti. Sono necessari studi ancora più approfonditi per migliorare i metodi e sviluppare l'applicabilità di queste tecniche per esperimenti futuri.

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