Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)

Questo metodo può aiutare a risolvere i problemi con i metodi convenzionali di coltivazione microbica. Fornisce una piattaforma sperimentale a basso costo, facile da usare e affidabile in termini di risultati per la coltivazione microbica automatizzata e l'evoluzione adattiva. Questa tecnologia automatizza le operazioni e riduce maggiormente il consumo di manodopera.

E allo stesso tempo, ha buone prestazioni culturali con risultati affidabili e operazioni semplici. La tecnologia è utilizzata principalmente nei campi di ricerca microbiologica, come la misurazione della curva di crescita, l'evoluzione adattiva del laboratorio e un'analisi multilivello a fattore singolo. Iniziare i preparativi dell'esperimento collegando l'ago della siringa con un diametro interno di 0,41 millimetri e un diametro esterno di 0,71 millimetri a un connettore rapido A e un flacone di reagente.

Quindi autoclave tutta l'attrezzatura a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Per installare il chip microfluidico, aprire la porta della camera operativa e sollevare la sonda in fibra ottica. Dopo aver allineato i fori del campo elettrico con gli aghi, posizionare delicatamente il chip sul piedistallo del chip, quindi inserire le due colonne di posizionamento nei fori di posizionamento e posizionare la sonda in fibra ottica.

Quindi, collegare il connettore rapido A sul chip alla porta corrispondente del sistema di coltura microbica a microgocciola o MMC in base al numero di posizione descritto nel manoscritto. Al termine, chiudere la porta della camera operativa. Diluire la sospensione di Escherichia coli MG1655 in coltura con il mezzo ad un OD600 da 0,05 a 0,1 per ottenere 10 millilitri di soluzione batterica iniziale.

Per inizializzare MMC, fare clic sulla scheda Inizializzazione. Quando viene visualizzata l'interfaccia di inizializzazione, impostare la temperatura di coltivazione su 37 gradi Celsius e il valore del segnale fotoelettrico su 0,6. L'inizializzazione richiederà circa 20 minuti.

Successivamente, posizionare un flacone di reagente sterilizzato sul banco pulito e stringere il tappo. Utilizzare una siringa sterile da 10 millilitri per iniettare da tre a cinque millilitri di olio MMC dall'ago della siringa al tubo laterale nel flacone del reagente. Quindi inclinare e ruotare lentamente il flacone del reagente per far sì che l'olio si infiltri completamente nella parete interna.

Dopo aver iniettato cinque millilitri di una soluzione batterica iniziale nella bottiglia, riempire la bottiglia del reagente iniettando da cinque a sette millilitri di olio MMC. Estrarre il connettore rapido indipendente A del flacone del reagente e inserire il connettore rapido A nel connettore rapido B del flacone per completare l'operazione di iniezione del campione. Una volta fatto, aprire la porta della camera operatoria per mettere la bottiglia del reagente nel bagno di metallo.

Estrarre il connettore C2 del chip e il connettore rapido A del flacone del reagente. Collegare il connettore del tubo laterale del flacone del reagente al connettore C2 e il connettore del tubo superiore al connettore O2. Quindi chiudere la porta della camera operativa.

Per scegliere la funzione di misurazione della curva di crescita, fare clic su Curva di crescita nell'interfaccia di impostazione dei parametri inserendo il numero come 15. Quindi accendere l'interruttore di rilevamento OD e impostare la lunghezza d'onda su 600 nanometri. Fare clic sulla scheda Start per avviare la generazione di droplet.

Il processo richiederà 15 minuti per essere completato. Quando viene visualizzata una finestra popup sull'interfaccia principale che richiede un messaggio, aprire la porta della camera operativa per estrarre il flacone del reagente e collegare i connettori C2 e O2. Dopo aver chiuso la porta, fare clic sul pulsante OK nella finestra popup per coltivare automaticamente le goccioline e rilevare i valori OD.

Quando la curva di crescita raggiunge la fase stazionaria, fare clic sul pulsante Esportazione dati per esportare i dati OD. Selezionare il percorso di salvataggio dei dati ed esportare il valore OD registrato durante il periodo di coltivazione nel formato CVS Per tracciare la curva di crescita, utilizzare software di mappatura come Excel e Origin 9.0. Iniettare i volumi necessari della soluzione batterica iniziale, del mezzo fresco e dell'olio MMC nei flaconi di reagente sterilizzati separati per la soluzione batterica iniziale nel mezzo fresco, come spiegato in precedenza.

Per scegliere la funzione di evoluzione adattiva, fare clic su ALE nel software. Nell'interfaccia di impostazione dei parametri, attivare l'interruttore di rilevamento OD, quindi impostare tutti i parametri descritti nel manoscritto e premere la scheda Start per avviare la generazione di droplet. Il processo richiederà circa 25 minuti.

Durante ogni periodo di sotto-coltivazione, osservare se i valori massimi di OD delle goccioline sono aumentati in modo significativo. Se l'aumento si verifica e soddisfa i requisiti dell'esperimento, fare clic sul pulsante di esportazione dei dati per esportare i dati OD. Per estrarre le goccioline di destinazione da MMC, fare clic sulla scheda di screening per selezionare la funzione di estrazione delle goccioline.

Quindi scegli l'opzione Raccogli e fai clic sul numero di droplet di destinazione. Al termine, fare clic su OK. Attendi che la finestra popup richieda un messaggio. Quindi inserire il connettore rapido CF nel tubo microcentrifuga per la raccolta e fare clic su OK. Dopo uno o due minuti, quando l'interfaccia del software aprirà una nuova finestra che richiede un messaggio, inserire nuovamente il connettore rapido CF e fare clic su OK per fare in modo che MMC continui a funzionare.

Quando il droplet di destinazione successivo raggiunge il sito di riconoscimento dei droplet, raccoglierlo come specificato in precedenza. Utilizzare una pipetta da 2,5 microlitri per estrarre e posizionare la goccia su una piastra solida da 90 millimetri, quindi distribuire uniformemente la goccia con un'asta rivestita triangolare di vetro con una lunghezza laterale di tre centimetri, quindi coltivare la goccia in un incubatore a temperatura costante a 37 gradi Celsius per 72 ore. Successivamente, scegli da tre a cinque colonie indipendenti di batteri per coltivare ogni colonia separatamente in un pallone da 50 millilitri con 10 millilitri di mezzo fresco in un incubatore vibrante a 200 rotazioni al minuto e 37 gradi Celsius per 48-72 ore.

Dopo l'incubazione, seguire le relative normative standard per conservare la soluzione batterica coltivata nel tubo del glicerolo. L'analisi rappresentativa mostra le curve di crescita di 50 goccioline nell'intero processo di evoluzione adattiva. È stato osservato che il ceppo essenziale di metanolo Escherichia coli o MeSV2.2 ha mostrato una crescita lenta iniziale seguita da una crescita rapida.

La curva di crescita delle goccioline sei nell'intero processo di evoluzione adattiva è stata tracciata separatamente. Il valore massimo di OD600 nella prima generazione era 0,37, che è aumentato a 0,58 nell'ultimo periodo di sotto-coltivazione, indicando che il ceppo nella goccia sei ha realizzato un'ovvia evoluzione adattativa. Inoltre, sono state confrontate le curve di crescita del ceppo a sei goccioline e del ceppo iniziale.

Il ceppo a sei goccioline ha mostrato un tasso di crescita specifico massimo e una concentrazione cellulare più elevati nella fase stazionaria rispetto al ceppo iniziale. La cosa più importante è assicurarsi che il collegamento del chip dello strumento e del flacone del reagente sia corretto, ovvero le goccioline affinché le operazioni procedano normalmente. Questo metodo fornisce ai ricercatori una nuova idea per la coltivazione di microrganismi e fornisce anche una piattaforma efficiente e a basso costo per l'evoluzione adattiva dei ceppi.