In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Questo video mostra come valutare l'immunogenicità in vivo delle vescicole extracellulari derivate dal tumore, o EV, utilizzando la citometria a flusso. Il metodo di screening qui descritto è relativamente facile da eseguire e può essere adattato a varie impostazioni. Nel cancro, identificare le condizioni di rilascio di vescicole extracellulari immunogeniche di particolare rilevanza traslazionale.

Come tale, i veicoli elettrici autologhi potrebbero essere utilizzati come trattamenti anti-cancro personalizzati. A dimostrare la prima parte della procedura sarà Tatiana Nedelko, assistente tecnica del mio laboratorio. Per iniziare la preparazione dei terreni di coltura cellulare necessari per le vescicole extracellulari, o EV, esaurire i veicoli elettrici bovini nei mezzi FCS mediante ultracentrifugazione a 100.000 volte g per 24 ore a 4 gradi Celsius.

Scartare il pellet dopo la centrifugazione. Raccogliere le cellule murine del melanoma B16 che esprimono ovalbumina, o cellule B16-OAV, dalla coltura e lavare le cellule due volte con PBS. Quindi, seminare le cellule ad una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro nel mezzo impoverito EV.

Successivamente, trattare le cellule B16-OVA con 30 microgrammi di oxaliplatino per millilitro e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con campioni di controllo non trattati. Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante per centrifugare a 400 volte g per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Scartare nuovamente il pellet prima della centrifugazione a 2.000 volte g per 30 minuti a 4 gradi Celsius.

Dopo aver scartato il pellet, filtrare il surnatante attraverso un filtro a membrana PVDF a 220 nanometri in un tubo fresco. Quindi, mescolare 1 millilitro di surnatante con 0,5 millilitri di uno specifico reagente di isolamento degli esosomi disponibile in commercio. Vortice e trasferire la miscela in tubi da 1,5 millilitri, seguiti da incubazione notturna a 4 gradi Celsius.

Il giorno successivo, centrifugare la miscela a 10.000 volte g per 60 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo aver scartato con cura il surnatante, rimuovere le gocce rimanenti picchiettando il tubo da 1,5 millilitri a testa in giù su un tovagliolo di carta e aspirando attraverso una punta fine di pipetta senza toccare il pellet EV sul fondo. Risospesso il pellet in PBS freddo tubando su e giù senza graffiare il pellet con la punta.

Quindi, raggruppa i veicoli elettrici da tutti i tubi. Se non si utilizza immediatamente, conservare le sospensioni EV a 80 gradi Celsius in recipienti siliconati per un massimo di 28 giorni fino all'applicazione. Per immunizzare ogni topo nel gruppo di trattamento con EV isolati da 4,0 x 10 alla quinta cellula B16-OAV, mescolare 5 microlitri della sospensione EV con 55 microlitri di PBS freddo.

Quindi, riempire le siringhe montate con aghi da 26 a 30 calibri con 60 microlitri dei veicoli elettrici diluiti o PBS e quindi mettere immediatamente la siringa sul ghiaccio. Inoculare i veicoli elettrici o PBS per via sottocutanea nell'aspetto mediale della coscia dei topi. Ripetere l'immunizzazione dopo sette giorni.

14 giorni dopo il primo trattamento, sacrificare i topi per resecare la milza. Quindi, schiacciare la milza resecata con un filtro cellulare inumidito da 100 micrometri e lo stantuffo di plastica di una siringa. Sciacquare le celle spleniche in un tubo da 50 millilitri con 5-10 millilitri del fresco RPMI completo.

Quindi, centrifugare le cellule a 400 volte g per cinque minuti a 4 gradi Celsius prima di scartare il surnatante. Per rimuovere gli eritrociti dalla sospensione cellulare, risospesciare e incubare il pellet cellulare con 2 millilitri del tampone di lisi dei globuli rossi per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, interrompere la reazione aggiungendo da cinque a 10 millilitri di RPMI completo, seguito dalla centrifugazione come descritto in precedenza.

Dopo aver risospeso il pellet cellulare in RPMI completo, contare le cellule di ogni topo e posizionare i triplicati di 200.000 splenociti con 200 microlitri di cRPMI in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con un fondo a forma di U. Quindi, incubare le piastre per 48 ore a 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore, trattare la coltura cellulare con 5 nanogrammi per millilitro Brefeldin A, 20 nanogrammi per millilitro PMA e 1 microgrammo per millilitro Ionomicina a 37 gradi Celsius per 4 ore.

Dopo l'incubazione, trasferire gli splenociti su una piastra a 96 pozzetti con un fondo a forma di V e lavare le cellule due volte con PBS. Risospesciare gli splenociti pellettati nella soluzione colorante appena preparata e incubare la sospensione cellulare per 30 minuti a 4 gradi Celsius al riparo dalla luce. Per la fissazione e la permeabilizzazione, lavare gli splenociti due volte nel tampone FACS e quindi risospesare gli splenociti in 100 microlitri per pozzetto della soluzione di fissazione e permeabilizzazione, seguita da incubazione al buio come spiegato in precedenza.

Per colorare l'interferone gamma intracellulare, lavare gli splenociti nel tampone di fissazione o permeabilizzazione prima di inviare nuovamente le cellule con gli anticorpi fluorescenti contro l'interferone gamma diluito 1:200 nel tampone. Incubare gli splenociti per 1-12 ore a 4 gradi Celsius al buio. Dopo un accurato lavaggio e risospensione nel tampone FACS, analizzare l'attivazione delle cellule T citotossiche secondo la strategia di gating spiegata nel manoscritto.

Nell'immagine rappresentativa, viene visualizzata la strategia di gating per analizzare l'attivazione delle cellule T citotossiche. Le cellule sono state chiuse come le singole cellule, il sottoinsieme di linfociti, le cellule T CD3-positive vitali e le cellule T citotossiche CD8-positive CD4-negative. L'accumulo intracellulare dell'interferone gamma è stato valutato come marcatore surrogato per l'attivazione.

Dopo l'immunizzazione con EV derivati dalle cellule tumorali, è stata studiata l'induzione delle risposte delle cellule T antigene-specifiche nei topi riceventi. I veicoli elettrici derivati dal tumore coltivati in condizioni di stress genotossico, come il trattamento con oxaliplatino, hanno indotto una potente attivazione delle cellule T citotossiche della milza in contrasto con i veicoli elettrici non trattati. Il gruppo di animali trattati con il veicolo ha mostrato la risposta più bassa.

L'attivazione delle cellule T spleniche è stata determinata dopo la ristimolazione ex vivo in presenza o assenza di ovoalbumina. La produzione dell'interferone gamma è aumentata quando gli splenociti degli animali trattati con EV tumorale sono stati ristimati con l'ovoalbumina dell'antigene tumorale modello prima dell'analisi. Si prega di notare che i risultati riproducibili si basano sulla costante efficacia di isolamento dei veicoli elettrici.

Pertanto, assicurarsi che i pellet EV siano risospesi interamente e prontamente per evitare l'essiccazione. Con questo protocollo, siamo stati in grado di analizzare percorsi specifici all'interno delle cellule tumorali che determinano l'immunogenicità degli EV derivati dalle cellule tumorali. Ciò potrebbe aprire la strada per sfruttare tali veicoli elettrici immunogenici nel trattamento del cancro.