Name: Efficacia dei batteriofagi per il biocontrollo dei patogeni di origine alimentare valutati tramite impostazioni ad alta produttività (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Scopri come valutare l'efficacia antibatterica di cocktail di batteriofagi in impostazioni ad alta produttività. Questo metodo ottimizza i trattamenti di biocontrollo contro i patogeni alimentari.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC Discovery Grant, RGPIN-2019-04384), dalla Canada Foundation for Innovation (Project # 38710) e dal Major Innovation Fund, Alberta. Ringraziamo il Dr. John Kastelic per aver curato il manoscritto.

1. Preparazione del tampone e dei reagenti
<ol><li>Produrre 500 ml di brodo di soia triptico (TSB) (15 g di polvere di TSB e 500 ml di acqua ultrapura) e autoclave. NOTA: Questo può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 3 mesi o a 4 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
	<li>Produrre 500 ml di agar di soia triptica (TSA) (20 g di polvere TSA e 500 ml di acqua ultrapura) e autoclave. NOTA: Può essere conservato a 4 °C per un massimo di 3 mesi.</li>
	<li>Produrre 500 mL di Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (PBS; 4 g di NaCl, 0,1 g di KCl, 0,77 g di Na2HPO4 e 0,12 g di KH2PO4, 500 mL di acqua ultrapura), misurare e regolare il pH a 7,2 ± 0,2 a 25 °C e autoclave. NOTA: Questo può essere conservato a 4 °C per un massimo di 6 mesi.</li>
	<li>Produrre 200 mL di 1 M MgSO4 (49,294 g e 200 ml di acqua ultrapura) e sterilizzare tramite filtro polietersolfone da 0,22 μm.</li>
	<li>Produrre 500 mL di TSB con 10 mM di MgSO4 (mTSB; 15 g di polvere di TSB, 500 mL di acqua ultrapura e 5 mL di 1 M MgSO4) e autoclave; lasciare raffreddare il fluido autoclavato a temperatura ambiente. Applicare la tecnica asettica. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire con cura 5,0 ml di 1 M MgSO4; ruotare delicatamente per mescolare.</li>
</ol>2. Preparazione della coltura batterica
<ol><li>Per preparare la coltura di laboratorio di ricerca batterica (BRLC), rimuovere le fiale di glicerolo dall'inventario del congelatore e trasferirle in laboratorio.</li>
	<li>Utilizzare un anello di inoculazione monouso o equivalente, immergere nel flaconcino, rimuovere un raschiamento di inoculo (granita congelata) e strisciare su una piastra TSA o equivalente all'interno di un armadio di sicurezza biologica di livello II. Incubare la piastra a 37 ± 2 °C per 15-18 ore.</li>
	<li>Insaccare le piastre BRLC preparate e conservare a 4 °C. NOTA: Periodo di scadenza generale per BRLC: 14 giorni a 4 °C dopo la generazione.</li>
	<li>Inoculare una singola colonia di ciascun ceppo di E. coli O157 dalle piastre BRLC da testare in 10 mL di TSB e incubare staticamente a 37 °C per 18 ore per raggiungere 9 log10 CFU/mL.</li>
	<li>Preparare una diluizione seriale delle colture notturne (la mattina seguente), ogni ceppo di E. coli O157 utilizzando mTSB contenente 10 mM di MgSO4 per ottenere 4-5 log10 CFU/ml (o altro livello di inoculo desiderato).</li>
	<li>Mescolare un volume uguale di una coltura notturna di ciascun ceppo per ottenere 4-5 log10 CFU / mL in totale (o come desiderato) per preparare la miscela batterica.</li>
	<li>Posizionare immediatamente la coltura batterica diluita a 4 °C per l'uso in sospeso.</li>
	<li>Diluire la coltura dell'inoculo di 10 o 100 volte e di placcare aliquote di 0,1 mL di queste diluizioni sulle piastre TSA per ottenere le colonie isolate.</li>
</ol>3. Preparazione di soluzioni di lavoro fagiche
<ol><li>Propagare le scorte di lavoro ad alto titolo per ciascun fago da sottoporre a screening (≥108 PFU/mL) seguendo i metodi standard4. NOTA: Il periodo di scadenza generale per le scorte di fagi è di 3 mesi in una bottiglia di plastica a 4 °C dopo la generazione.</li>
	<li>Per ottenere il titolo desiderato di, ad esempio, ~ 108 PFU / mL per la cinetica della lisi, diluire i singoli preparati fagici con mTSB contenente 10 mM di MgSO4. Preparare cocktail di fagi mescolando volumi uguali di ogni stock di lavoro con lo stesso titolo in tutte le combinazioni possibili.</li>
</ol>4. Preparazione della cinetica di lisi in vitro per singoli cocktail di fagi e fagi
<ol><li>Preparare diluizioni seriali 10 volte di ciascun fage nelle colonne 1-8 in micropiastre sterili a 96 pozzetti per impostare il test delle micropiastre. NOTA: Quattro fagi contro un ceppo batterico possono essere testati in duplice copia, in colonne adiacenti, su ogni piastra. Le restanti quattro colonne sono per i controlli, che sono senza fago, così come mTSB vuoto (Figura 1).</li>
	<li>Posizionare 180 μL di mTSB ai pozzi dalle colonne da 1 a 12 della micropiastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di singoli fagi diluiti o cocktail di fagi (~ 108 PFU / mL) ai pozzetti 1-8 della fila superiore della micropiastra (riga A).</li>
	<li>Per il controllo senza fagi e Blank, aggiungere 20 μL di mTSB al pozzetto superiore delle colonne 9, 10 e 11.</li>
	<li>Con una pipetta a 12 canali, diluire la piastra. Trasferire 20 μL da una fila all'altra. Mescolare il contenuto del pozzo mediante aspirazione delicata e ripetuta, espulsione (almeno cinque volte) e cambio di punte tra le diluizioni. Rimuovere 20 μL dall'ultima riga (riga H). NOTA: si consiglia di utilizzare punte con filtri per prevenire la contaminazione incrociata.</li>
	<li>Impostare un serbatoio per ogni ceppo, utilizzare 1 mL di pipetta per trasferire 2-3 mL della coltura diluita nel serbatoio. Per le colonne 1-10, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 20 μL di coltura batterica diluita a ciascun pozzetto. Cambia i suggerimenti tra ogni aggiunta.</li>
	<li>Coprire e incubare la micropiastra alle condizioni desiderate (ad esempio, 37 °C per 10 ore o 22 °C per 22 ore).</li>
	<li>A 2 ore o altri intervalli desiderati, rimuovere le micropiastre dall'incubatore.</li>
</ol>5. Determinazione della densità ottica
<ol><li>Esaminare la densità ottica a 600 nm (OD600nm) utilizzando un lettore di micropiastre. NOTA: Si consiglia di impostare e salvare il protocollo di analisi nel programma prima della preparazione della piastra di prova.</li>
	<li>Accendere il lettore di micropiastre e aprire il programma.</li>
	<li>Selezionare la modalità Semplice nella finestra Opzioni di avvio e selezionare Crea un nuovo protocollo in Task Manager (Figura supplementare 1a,b).</li>
	<li>Dalla finestra Seleziona tipo di piastra , scegliere Piastra pozzo 96 dall'elenco a discesa (Figura supplementare 2).</li>
	<li>Selezionare Assorbanza per il metodo di rilevamento, l'opzione Endpoint/Kinetic per il tipo di lettura e Monocromatori per il tipo di ottica. Fare clic su OK (Figura supplementare 3).</li>
	<li>Per Passo di lettura, immettere 600 nm per le lunghezze d'onda e selezionare Normale per la velocità di lettura. Fare clic su OK (Figura supplementare 4).</li>
	<li>Per impostare la temperatura per il test, fare clic sulla casella di controllo Incuba e selezionare Incubatore acceso. Immettere la temperatura desiderata nella casella Temperatura . Fare clic su OK. Per evitare la condensa sul coperchio della piastra durante l'incubazione, impostare un gradiente di temperatura inserendo un valore (1-3) nella casella Gradiente . Fare clic su OK (Figura supplementare 5a). NOTA: fare clic sulla casella di controllo Preriscaldamento prima di continuare con il passaggio successivo per la temperatura di incubazione di 37 °C. Questo passaggio non è richiesto per la condizione di prova a 22 °C (RT).</li>
	<li>Quindi, fare clic sulla casella di controllo Cinetica per aprire Configurazione cinetica. Impostare il tempo di esecuzione per 10 ore per l'incubazione a 37 °C o 22 ore per RT. Immettere 2 ore per l'intervallo di lettura. Fare clic su OK (Figura supplementare 5b).</li>
	<li>Fare clic sulla casella di controllo Agitare nella finestra Procedura per impostare la condizione di agitazione, se necessario, per ogni lettura cinetica (Figura supplementare 6a).</li>
	<li>Selezionare Lineare per le modalità di agitazione e modificare Durata su 30 s. Impostare il valore della frequenza lineare su 731 cpm (2 mm), quindi fare clic su OK (Figura supplementare 6b).</li>
	<li>Nella finestra di dialogo Riepilogo protocollo , fare clic su Layout piastra e selezionare Spazi vuoti, Controlli analisi e Campioni. Fare clic su Avanti (Figura supplementare 7). NOTA: immettere 1 in Numero di diversi tipi di controllo per il controllo negativo.</li>
	<li>Dopo aver definito le impostazioni per ogni tipo di pozzo, fare clic su Fine.</li>
	<li>Selezionare un ID pozzo nell'interfaccia a sinistra, quindi assegnarlo alla matrice mostrata nella vedova del layout della piastra. Fare clic su OK (Figura supplementare 8).</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Leggi piastra e salvare il protocollo come file .prt e fare clic su Salva (Figura supplementare 9).</li>
	<li>Inserire la piastra e fare clic su OK.</li>
	<li>Una volta completato l'esperimento, salvare l'esperimento come file .xpt e fare clic su Salva (Figura 10 supplementare).</li>
	<li>Esportare i dati in Excel facendo clic sul pulsante Sì nella finestra del messaggio per ulteriori analisi (Figura supplementare 11).</li>
	<li>Fare clic sulla selezione Salva Sì/No e sulla casella di controllo Non chiedere di nuovo per salvare la preferenza.</li>
</ol>6. Analisi dei dati
<ol><li>Ripeti almeno due esperimenti indipendenti come descritto sopra. Compilare i risultati di tutti gli studi indipendenti. Calcola la deviazione media e standard dell'OD600 da ogni coltura trattata con fagi e libera.</li>
	<li>Eseguire la radice quadrata dei valori OD a 600 nm e analizzarli utilizzando un modello statistico appropriato per ogni ceppo batterico e temperatura. NOTA: per il software SAS, vengono selezionati il modello MIXED e i minimi quadrati per differenziare le medie (P < 0,05). Per ogni ceppo, assegnare pannelli A-G a ciascun trattamento fagico di cui l'efficacia complessiva dell'anti-O157 nel tempo e i MOI differivano (P < 0,05).</li>
	<li>Definire l'efficacia dei fagi superiore in base al valore di OD600nm ≤ 0,01 corrispondente a nessuna crescita batterica rilevabile (limite di rilevazione: 300 CFU / mL).<ol>
<li>Analizzare gli effetti del tempo, della temperatura di incubazione, dei ceppi di E. coli O157, dei MOS e dei tipi di fagi sull'efficacia dei fagi utilizzando un modello statistico appropriato. NOTA: per il software SAS, utilizzare GLIMMIX con misure casuali.</li>
		<li>Calcola gli odds ratio per confrontare l'efficacia superiore per diversi fattori ambientali e biologici di interesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Carvalho, C., Costa, A. R., Silva, F., Oliveira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+and+their+derivatives+for+the+treatment+and+control+of+food-producing+animal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages and their derivatives for the treatment and control of food-producing animal infections.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (5), 583-601 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Questo protocollo descriveva un approccio robusto per valutare sistematicamente l'efficacia dei fagi contro i patogeni di origine alimentare, tra cui STEC9 e Salmonella10. Un passaggio critico è quando si diluisce la coltura notturna di batteri, si consiglia di utilizzare un mezzo pre-refrigerato e manipolare la diluizione con un secchiello del ghiaccio per ridurre al minimo la potenziale crescita batterica. Inoltre, la diluizione dei fagi è stata preparata prima di diluire la coltura batterica. La fase di enumerazione 2.8 ha fornito il numero effettivo di inoculo batterico per il calcolo del MOI finale applicato. Per la preparazione dei fagi, vengono generalmente utilizzati lisati di fagi grezzi preparati da fagi filtranti infetti in 4-6 ore di coltura batterica. Il passaggio critico associato all'infettività dei fagi è sempre quello di utilizzare scorte di lavoro dei fagi preparate entro 3 mesi. Anche il pipettaggio estremamente accurato (in particolare quando si utilizza una pipetta multicanale) e l'uniformità di approccio sono essenziali per ottenere risultati comparabili e interpretabili. Il TSB modificato integrato con 10 mM di Mg2+ è stato utilizzato per diluire i fagi, la coltura batterica e il mezzo di base per ottimizzare l'adsorbimento e l'infezione dei fagi.
Poiché i batteri proliferano durante la fase log, anche al di sotto della temperatura dell'incubatore, si consiglia di utilizzare la coltura notturna diluita anziché la coltura log-phase, per ridurre al minimo la potenziale crescita batterica.
Il protocollo proposto presenta delle limitazioni. In primo luogo, poiché la micropiastra può contenere solo 200 μL, l'incubazione prolungata può causare un'evaporazione sostanziale e non è raccomandata. In questo caso, il test potrebbe non essere adatto per i batteri a crescita lenta. In secondo luogo, il protocollo proposto non è stato in grado di monitorare l'amplificazione dei fagi. In terzo luogo, questo protocollo non ha potuto monitorare lo sviluppo della resistenza dei fagi nel tempo, un fattore critico che determina l'esito del trattamento dei fagi11,12. Sono necessari esperimenti di follow-up per valutare le ulteriori prestazioni del cocktail più influente nello screening nel prevenire l'emergere di mutanti anti-fagi in un ampio sistema di coltura del brodo e in altre matrici biologiche.
A differenza degli antimicrobici convenzionali, la natura biologica dei fagi influisce sulla complessità del biocontrollo e dell'uso terapeutico in contesti pratici. Convenzionalmente, la selezione razionale dei cocktail di fagi si basa principalmente sull'attività litica e sulla gamma di fagi dell'ospite. I candidati fagi con la più forte attività litica e la più ampia gamma di ospiti sono spesso raccomandati13,14. Tuttavia, sulla base del presente studio, fagi come rV5 e T1, sebbene da soli non così virulenti come T4 e T5, hanno notevolmente facilitato l'esito complessivo del biocontrollo quando combinati con T4 e / o T5. Di conseguenza, per ottenere un'efficacia superiore dei cocktail di fagi, si raccomanda lo screening sistemico dell'attività antibatterica di potenziali combinazioni di fagi contro ceppi di ospiti mirati nelle condizioni ambientali desiderate. Inoltre, la determinazione dei recettori per i candidati fagi e l'inclusione dei fagi con vari recettori possono prevenire la competizione per l'attaccamento dell'ospite, ostacolare il rapido sviluppo di mutanti antifagici e migliorare i risultati del biocontrollo13.
Questo metodo ha consentito una quantificazione accurata della cinetica della lisi dei fagi in un formato ad alto rendimento. Inoltre, ha permesso la valutazione sistematica di vari fattori biologici e ambientali sull'efficacia antibatterica di un assortimento di fagi, facilitando così la formulazione di cocktail di fagi con risultati ottimizzati. Si presume che le future applicazioni e lo sviluppo del metodo comportino il monitoraggio in situ dell'efficacia di ciascun fage all'interno di cocktail di fagi mediante l'etichettatura a fluorescenza dei fagi. Oltre al protocollo proposto, la comprensione dei determinanti genetici che promuovono effetti sinergici e facilitati tra i fagi quando si co-infetta un ospite faciliterebbe la formulazione di cocktail di fagi appropriati con un'efficacia superiore.

I batteriofagi (fagi) sono virus che invadono naturalmente le cellule batteriche, interrompendo il metabolismo batterico e causando la lisi del batterio. A differenza degli antimicrobici convenzionali (ad esempio, antibiotici), gli spettri degli ospiti fagi sono relativamente ristretti, in grado di infettare solo un insieme mirato di specie o ceppi batterici e quindi dovrebbero ridurre al minimo gli effetti collaterali sul microbiota che avvantaggiano la salute animale e umana. Con l'aumento della resistenza antimicrobica (AMR), i fagi e i loro derivati portano ad antimicrobici alternativi per controllare le malattie infettive batteriche, comprese le infezioni batteriche AMR nell'uomo e negli animali1,2. I fagi hanno confermato il potenziale terapeutico contro >20 patogeni batterici che causano infezioni superficiali e infezioni del sistema respiratorio superiore e del tratto gastrointestinale dell'uomo3.
In ambito agricolo, una strategia di biocontrollo basata sui fagi è l'uso terapeutico dei fagi per controllare i patogeni batterici. Il biocontrollo dei fagi è ben accettato come una tecnologia verde, efficace nel decontaminare gli agenti patogeni di origine alimentare (ad esempio, la tossina Shiga che produce Escherichia coli (STEC), Salmonella e Listeria) in vari alimenti4,5. Inoltre, i fagi possono essere utilizzati come disinfettanti per disinfettare le superfici di lavorazione degli alimenti e le pelli di animali, che possono essere integrati nei sistemi antimicrobici convenzionali (ad esempio, prodotti chimici, vapore e pastorizzazione dell'acqua calda) per migliorare i risultati desiderati e ridurre gli impatti ambientali. Anche l'uso di fagi per ridurre i batteri zoonotici negli animali è promettente1. Tuttavia, è necessario affrontare le sfide tecniche per migliorare i risultati dell'approccio di biocontrollo dei fagi da applicare popolarmente in diversi sistemi di produzione alimentare. La sfida principale è la compromissione dell'efficacia dei fagi dovuta allo sviluppo di mutanti resistenti ai batteri5 e ai cambiamenti nella fisiologia batterica dovuti all'esposizione a fattori di stress ambientali6.
Per ridurre al minimo il rischio di resistenza ai fagi, vengono proposti cocktail di fagi (cioè una combinazione di più fagi) che hanno migliorato la potenza del biocontrollo in agricoltura e acquacoltura7. Tuttavia, da diversi studi, è stato dimostrato che i cocktail di fagi non sempre offrivano un'efficacia migliore rispetto alla somministrazione di un singolo fago. Ad esempio, un cocktail di 3 fagi simili a T4 aveva un intervallo ospite più ristretto contro i ceppi di E. coli8. Inoltre, AKFV33, un membro del Tequintavirus, ha avuto una maggiore efficacia di un cocktail di quattro fagi nel rimuovere E. coli O157 dalla carne bovina, nonostante le temperature di incubazione applicate4. Recentemente, è stato riportato che l'efficacia dei singoli fagi non predice l'efficacia dei cocktail di fagi per il controllo di O1579, poiché le interazioni tra più fagi possono alterare l'efficacia. Ancora più importante, numerosi fattori, come generi e combinazioni di fagi, ceppi e MOI mirati e temperature e tempi di incubazione, possono influire sulle interazioni tra i fagi. Pertanto, lo screening attento delle combinazioni di fagi contro batteri specifici per valutare la sinergia o la facilitazione dei fagi, o almeno per garantire un antagonismo minimo dei fagi in condizioni ambientali specifiche, è di vitale importanza per risultati ottimali. Qui, viene descritto un metodo per valutare sistematicamente l'efficacia di varie combinazioni di fagi contro agenti patogeni di origine alimentare in una serie di condizioni ambientali. Il vantaggio di questo approccio è quello di consentire lo screening di tutti i possibili fattori biotici e abiotici che si prevede influenzino l'efficacia antibatterica dei fagi in ambienti naturali. Nel protocollo, STEC O157 e i loro fagi infettivi sono impiegati come esempio.

<table><tbody><tr><td>Forniture essenziali, reagenti e attrezzature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anse di inoculazione VWR</td><td></td><td>12000-806</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>1374361</td><td>MgSO4.7H2O</td></tr><tr><td>Piastre Petri con coperchio trasparente</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Diametro: 100 mm, sterili</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Pipetta Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pipet-Lite LTS L-300XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014405</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multipla Pipet-Lite L12-20XLS+</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pipet-Lite, Unv. Puntali</td> per pipette <td>17014412</td><td></td>SL-20XLS+<td>METTLER TOLEDO</td></tr><tr><td>RT LTS 1000&micro; L FL 768A/8 Puntali</td> per pipette <td>METTLER TOLEDO</td><td>30389213</td><td></td>a bassa ritenzione</tr><tr><td>SR LTS 20&micro; Puntali</td> per pipette <td>17005860</td><td></td><td>METTLER TOLEDO</td> 960A/5</tr><tr><td>SR LTS 300&5 METTLER TOLEDO L 768A/4</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17005867</td><td>senza filtro</td></tr><tr><td>Serbatoio</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>89094-662</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre sterili, trasparenti, a fondo piatto a 96 pozzetti in polistirene con coperchi Fisher</td><td></td><td>168055</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy agar (TSA)</td><td>Sigma</td><td>105458-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy broth (TSB)</td><td>Sigma</td><td>105459-0500</td><td></td></tr><tr><td>Cella a forma di T Spandiconcime</td><td>VWR</td><td>76299-566</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice analogico</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Incubatori microbiologici compatti Fisher</td><td></td><td>50125590H</td><td></td></tr><tr><td>Piastre riscaldanti per agitatore magnetico</td><td>FIsher</td><td>13-889-335</td><td></td></tr><tr><td>Barre di agitazione poligonali</td><td>FIsher</td><td>14-512-125</td><td>lunghezza: 20 mm</td></tr><tr><td>Synergy Neo2 Lettore multimodale ibrido</td><td>Fisher</td><td>BTNEO2M</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAS SAS</td><td>Institute</td><td>9.4</td><td></td></tr></tbody></table>

efficacia dei batteriofagi per il biocontrollo dei patogeni di origine alimentare valutati tramite impostazioni ad alta produttività

Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings

I patogeni batterici sfidano continuamente i sistemi di sicurezza alimentare in tutto il mondo. Con le crescenti preoccupazioni per l'emergere di batteri resistenti al calore e ai disinfettanti, sono urgentemente necessari nuovi agenti antibatterici. Una strategia di biocontrollo basata sui batteriofagi è l'uso terapeutico dei fagi per controllare i patogeni batterici in ambienti agricoli. Il biocontrollo dei fagi è sempre più accettato come una tecnologia sostenibile, efficace nel decontaminare gli agenti patogeni di origine alimentare. Per garantire risultati di biocontrollo efficaci, è fondamentale lo screening sistematico delle combinazioni di fagi contro batteri mirati nelle condizioni ambientali richieste. L'efficacia antibatterica dei cocktail di fagi può essere influenzata dai generi e dalla combinazione di fagi, dai ceppi batterici mirati, dalla molteplicità di infezioni, dalla temperatura e dal tempo. Per formulare un cocktail di fagi con un'efficacia superiore, il metodo proposto era quello di valutare sistematicamente l'efficacia dei singoli fagi e cocktail di fagi nell'uccidere i patogeni batterici di origine alimentare in condizioni mirate. L'efficacia dell'uccisione batterica è stata monitorata misurando la densità ottica alle temperature e alle durate desiderate. L'efficacia superiore dei fagi è stata determinata dalla completa inibizione della crescita batterica. Il metodo proposto è un approccio robusto e basato sull'evidenza per facilitare la formulazione di cocktail di fagi con efficacia antibatterica superiore.

Seguendo il protocollo, è stato eseguito un confronto dell'efficacia dei fagi anti-O157 con varie combinazioni di fagi, temperature, tempi e MOI. Gli impatti della temperatura e dei tempi di incubazione, dei MOI, dei fagi e dei ceppi batterici utilizzati per migliorare l'efficacia dell'anti-E. coli O157 sono presentati nella Tabella 1 (tabella dell'odds ratio)9. La percentuale (%) di misurazione della torbidità ottica ≤ 0,01 prodotta è stata analizzata da ciascun preparato fagico in ciascuna condizione sperimentale. Sulla base di questa analisi, l'efficacia dei fagi anti-O157 è stata massimizzata dopo 14, 16 o 18 ore di incubazione a 22 °C (P &lt; 0,001) e MOI = 1000 (P &lt; 0,001), con il 75% e l'89% della crescita della coltura trattata con fagi completamente inibiti, rispettivamente. In generale, tra 11 preparazioni di fagi, un cocktail di T1, T4 e rV5 era più efficace (P &lt; 0,05) contro O157. Inoltre, tra temperature di incubazione, tempi, MOS e fagi testati, la sensibilità ai fagi variava, con i ceppi di O157 testati con il ceppo CO281-31N che erano più sensibili (P &lt; 0,001) e 3081 (P &lt; 0,001) che erano meno sensibili ai fagi.
Per comprendere la cinetica di uccisione dei fagi di ciascun ceppo batterico testato, il valore di OD600 è stato tracciato rispetto a ogni tempo di campionamento, MOI e trattamento dei fagi a ciascuna temperatura di incubazione. I risultati rappresentativi dell'efficacia dei fagi contro E. coli O157 3081 a 37 °C sono mostrati nella Figura 2. Si assicura che la curva di crescita della coltura di controllo senza fagi sia normale prima di valutare l'inibizione della curva di crescita della coltura trattata con fagi. Secondo la Figura 2, l'inclusione di T4 ha completamente inibito la crescita batterica a 37 °C, ad ogni momento di campionamento a un MOI a partire da 1. Per una panoramica di come i fagi hanno inibito la crescita batterica nel tempo a varie temperature, indipendentemente dai MOI, il valore medio di OD600nm mediato da tutti i MOI (MOI &gt; 0) è stato tracciato rispetto a ciascun tempo di campionamento e trattamento dei fagi (Figura 3). Rispetto a 37 °C, una particolare efficacia di uccisione dei fagi, ad esempio i fagi T4 e T1 + T4, è stata migliorata di oltre 22 °C. Un altro approccio per riassumere e confrontare l'efficacia complessiva dell'anti-O157 tra i fagi è mostrato nella Tabella 2 e nella Tabella 39. Il valore di OD600 è stato mediato da ogni tempo di campionamento e MOI e ha classificato l'efficacia dei fagi dal più alto (A) al più basso (F: 37 ° C e D: 22 ° C). Questa tabella facilita l'identificazione del miglior trattamento dei fagi. Ad esempio, per il ceppo 3081, i fagi T4 e T5 + T4 (pannello A) sono stati il trattamento più efficace a 37 °C, mentre oltre al fago T4, i fagi T1 + T4, T1 + T4 + rV5 e 4 cocktail di fagi (pannello A) sono stati il trattamento più efficace a 22 °C.
Questo protocollo ci ha anche permesso di confrontare l'efficacia dei fagi con vari ceppi batterici mirati e personalizzare la preparazione dei fagi. Ad esempio, quando si selezionano i fagi, a 37 °C, escluso il ceppo 3081, il fago T1 + T4 + rV5 ha avuto l'efficacia più significativa rispetto a tutti gli altri ceppi, indipendentemente dal loro tipo di fagi. A 22 °C, il cocktail a 4 fagi è stato il più efficace contro tutti i ceppi testati. I migliori MOI hanno portato a una lisi completa (OD600 ≤ 0,01), che ha garantito una potenziale efficacia superiore in condizioni sperimentali (Tabella 2 e Tabella 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig01.jpg"> Figura 1: Layout suggerito del test della micropiastra a 96 pozzetti. Le diluizioni seriali 10 volte di ciascun fago sono preparate nelle colonne 1-8 di micropiastre sterili a 96 pozzetti. Quattro fagi contro un ceppo batterico possono essere testati in duplice copia, in colonne adiacenti, su ogni piastra. Le colonne rimanenti sono per i controlli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig02.jpg"> Figura 2: Curve di crescita di E. coli O157 ceppo 3081 a 37 °C trattati e non trattati con fagi in ciascun MOS. I dati sono stati compilati da due studi indipendenti. Le barre presentano una deviazione standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62812/62812fig03.jpg"> Figura 3: Curve di crescita dei ceppi E. coli O157 ceppo 3081. (A) Curve di crescita a 37 °C. (B) Curve di crescita a 22 °C. Ogni curva rappresenta colture individuali e miste, trattate e non trattate con fagi attraverso i MOS. I dati sono stati compilati da due studi indipendenti. Le barre presentano l'errore standard della media (adattato da Reference9 con autorizzazione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Odds ratio che confrontano la probabilità di un'efficacia fagica superiore rispetto a E. coli O157 a temperature di incubazione, tempi di incubazione, MOI, fagi e ceppi di E. coli O157 (adattato da Reference9 con il permesso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%201_Final_.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Efficacia complessiva dei fagi contro E. coli O157 a 37 °C (adattata da Reference9 con autorizzazione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%202_Final_.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Efficacia complessiva dei fagi contro E. coli O157 a 22 °C (adattata da Reference9 con autorizzazione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/62812_Table%203_Final.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Figure supplementari 1-11: Istantanee del funzionamento e delle procedure del lettore di micropiastre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62812/Niu_Supplementary%20Information.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive un metodo robusto per l'utilizzo di impostazioni ad alto rendimento per esaminare l'efficacia antibatterica dei cocktail di batteriofagi.

Efficacia dei batteriofagi per il biocontrollo dei patogeni di origine alimentare valutati tramite impostazioni ad alta produttività

Bacterial pathogens continually challenge food safety systems worldwide. With increasing concerns about the emergence of heat- and sanitizer-resistant ...

Questo protocollo facile da eseguire valuta l'efficacia antibatterica di diverse combinazioni di batteriofagi, noti anche come cocktail di fagi, in condizioni variabili in un ambiente ad alto rendimento. I principali vantaggi della tecnica sono la capacità di trasmettere diversi biotici e fattori abiotici, come la temperatura, che possono influenzare l'efficacia dei fagi in una serie di condizioni ambientali. Questo metodo può facilitare la progettazione di cocktail di fagi appropriati per migliorare il biocontrollo e gli esiti terapeutici e determinare l'interazione tra ospiti batterici e batteriofagi.Per cominciare, impostare il test della micropiastra utilizzando punte filtrate per evitare la contaminazione incrociata. In primo luogo, aggiungere 180 microlitri di mTSB nei pozzetti delle colonne da uno a 12 della micropiastra a 96 pozzetti, quindi preparare diluizioni seriali dieci volte di ciascun fago in colonne da uno a otto delle micropiastre sterili a 96 pozzetti per impostare il test. Aggiungere 20 microlitri di singoli fagi o cocktail di fagi ai pozzetti da uno a otto della fila superiore A della micropiastra.Per un controllo senza fagi e in bianco, aggiungere 20 microlitri di mTSB al pozzetto superiore delle colonne da nove a 12. Durante il pipettaggio, mescolare il contenuto del pozzo con un'aspirazione delicata e ripetuta almeno cinque volte e cambiando le punte tra le diluizioni. Rimuovere 20 microlitri dall'ultima fila H, quindi creare un serbatoio per il ceppo batterico testato trasferendo da due a tre millilitri della coltura diluita nel serbatoio utilizzando una pipetta da un millilitro.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 microlitri della coltura batterica diluita a ciascun pozzetto in colonne da uno a 10 mentre si cambiano le punte tra ogni aggiunta. Coprire e incubare la micropiastra a 37 gradi Celsius. A intervalli di due ore, rimuovere la micropiastra dall'incubatore e leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiastre.In alternativa, incubare la piastra in un lettore di micropiastre e leggerla nel tempo. Per esaminare la densità ottica a 600 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre, aprire il programma su un lettore di micropiastre. Selezionare la modalità semplice nella finestra delle opzioni di avvio, quindi selezionare Crea un nuovo protocollo in Task Manager.Dalla finestra Seleziona tipo di piastra, scegliete Piastra a 96 pozzetti dall'elenco a discesa. Come metodo di rilevamento, selezionare Assorbanza per il tipo di lettura, selezionare l'opzione Endpoint/Cinetica per il tipo di ottica, selezionare Monocromatori e quindi fare clic su OK. Per Read Step, immettere 600 nanometri per le lunghezze d'onda, selezionare Normale per la velocità di lettura e fare clic su OK.To impostare la temperatura per il test, fare clic sulla casella di controllo Incuba e selezionare Incubator On.Immettere la temperatura desiderata nella casella temperatura e quindi fare clic su OK. Fare clic sulla casella di controllo Preriscaldamento prima di continuare con il passaggio successivo per la temperatura di incubazione di 37 gradi Celsius, sebbene l'opzione non sia richiesta per le condizioni di prova a 22 gradi Celsius. Per evitare la condensa sul coperchio della piastra durante l'incubazione, impostare il gradiente di temperatura immettendo un valore nella casella della sfumatura e quindi fare clic su OK. Quindi, fare clic sulla casella di controllo Cinetica per aprire l'impostazione cinetica.Impostare il tempo di esecuzione per 10 ore per l'incubazione a 37 gradi Celsius o 22 ore per la temperatura ambiente e immettere due ore come intervallo di lettura, quindi fare clic su OK. Fare clic sulla casella di controllo Agita nella finestra della procedura per impostare la condizione di scuotimento, se necessario per ogni lettura cinetica. Selezionare Lineare come modalità Shake e modificare la durata su 30 secondi. Impostare il valore frequenza lineare su 731 cicli al minuto, quindi fare clic su OK.In finestra di dialogo Riepilogo protocollo, fare clic su Layout piastra, selezionare Spazi vuoti, Controlli analisi e Campioni e fare clic su Avanti.Dopo aver definito le impostazioni per ogni tipo di pozzo, fare clic su Fine. Selezionare un ID pozzo nell'interfaccia a sinistra, assegnarlo alla matrice mostrata nella finestra Layout piastra, quindi fare clic su OK. Fare clic sul pulsante Leggi piastra, salvare il protocollo come file prt e fare clic su Salva. Inserire la piastra e fare clic su OK. Una volta completato l'esperimento, salva l'esperimento come file xpt e fai clic su Salva.Esportare i dati in Excel facendo clic sul pulsante Sì nella finestra del messaggio per ulteriori analisi. Fare clic sulla selezione Salva Sì/No e sulla casella di controllo Non chiedere più per salvare la preferenza. Seguendo il protocollo, è stato eseguito un confronto dell'efficacia dei fagi con varie combinazioni di fagi, temperature, tempi e molteplicità di infezioni, o MOI.Sulla base di questa analisi, l'efficacia dei fagi anti-O157 è stata massimizzata dopo 14, 16 o 18 ore di incubazione a 22 gradi Celsius. Per comprendere la cinetica di uccisione dei fagi dei batteri, i valori OD a 600 nanometri sono stati tracciati rispetto al tempo di campionamento, ai MOS e al trattamento dei fagi. Vengono mostrate le curve di crescita batterica rappresentative a 37 gradi Celsius trattati.T4 ha completamente inibito la crescita batterica ad ogni momento di campionamento anche a basso MOI. Per analizzare la crescita batterica inibita dai fagi, i valori medi di OD di tutti i MOI sono stati tracciati rispetto a ciascun tempo di campionamento e trattamento dei fagi. I grafici rappresentativi a due temperature hanno rivelato che l'efficacia di uccisione dei fagi, ad esempio, per T1 più T4 è stata migliorata a 22 gradi Celsius rispetto a 37 gradi Celsius.Viene mostrato il confronto dell'efficacia complessiva dei fagi, il che facilita l'identificazione del miglior trattamento di fase. Ad esempio, per il ceppo di Escherichia coli 3081, il trattamento con fagi T4 e T5 più T4 è stato il trattamento più efficace a 37 gradi Celsius. Tuttavia, a 22 gradi Celsius, oltre a T4, il fago T1 più T4, T1 più T4 più rV5 e quattro cocktail di fagi erano efficaci.Quando si esegue questa procedura, un pipettaggio estremamente accurato, in particolare quando si utilizza una pipetta multicanale e l'uniformità di approccio sono essenziali per ottenere risultati comparabili e interpretabili. Sono necessari esperimenti di follow-up per valutare le ulteriori prestazioni del cocktail più influente nello screening, prevenendo l'emergere di mutanti antifagici in un ampio sistema di coltura del brodo e in altre matrici biologiche.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Efficacia dei batteriofagi per il biocontrollo dei patogeni di origine alimentare valutati tramite impostazioni ad alta produttività (Video) | JoVE Journal

Efficacia dei batteriofagi per il biocontrollo dei patogeni di origine alimentare valutati tramite impostazioni ad alta produttività

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