Formulazione e modulazione acustica di nanogoccioline di perfluorocarburi vaporizzate otticamente

Questo protocollo consente una sintesi semplice e rapida di nanogoccioline di perfluorocarburo vaporizzate otticamente e fornisce un metodo per migliorare le prestazioni di queste particelle. La versione Person consente di migliorare il contrasto semplicemente manipolando prima la fase dell'imaging ecografico. Non richiede apparecchiature aggiuntive e può essere eseguito su qualsiasi sistema ad ultrasuoni programmabile.

Iniziare sciacquando un matraccio a fondo rotondo da 10 millilitri con cloroformio e lavare una siringa di vetro a tenuta di gas da 10 microlitri e un millilitro con cloroformio aspirando ripetutamente l'intero volume della siringa ed espellendolo per un totale di tre volte. Utilizzando le siringhe, aggiungere 200 microlitri di 25 milligrammi per millilitro DSPE-mPEG-2000, otto microlitri di DSPC da 10 milligrammi per millilitro e un millilitro di un milligrammo per millilitro IR-1048 nel pallone inferiore rotondo. Ricordarsi di pulire le siringhe tra i lipidi o il colorante per evitare la contaminazione nel brodo.

Rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante. Assicurarsi che il vuoto sia regolato lentamente a 332 millibar per evitare urti. Dopo cinque minuti, ridurre la pressione a 42 millibar per rimuovere l'acqua che potrebbe essere entrata nella soluzione.

Sospendere la torta lipidica in un millilitro di PBS e sonicare o vortice a temperatura ambiente per cinque minuti o fino a quando tutta la torta lipidica è stata sospesa e sciolta nella soluzione. Trasferire la soluzione in un flaconcino di vetro da sette millilitri e mettere il flaconcino in un piatto di vetro pieno di ghiaccio per consentire alla soluzione di raffreddarsi per cinque minuti. Risciacquare una siringa di vetro a tenuta di gas con perfluoroesano.

Quindi aggiungere 50 microlitri di perfluoroesano al flaconcino usando la siringa. La sonda sonica la miscela con l'ampiezza impostata su uno, il tempo di processo impostato su 20 secondi, l'impulso impostato su un secondo e l'impulso off impostato su cinque secondi. Quindi modificare le impostazioni come menzionato nel manoscritto di testo e sonicare la miscela ancora una volta.

Trasferire la soluzione di nano goccioline in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 300 g per tre minuti per separare le goccioline più grandi che sono più di un micrometro dalle goccioline più piccole. Scartare il pellet e trasferire il surnatante in un altro tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Lavare il surnatante centrifugando a 3.000 g per cinque minuti per pellettare tutte le goccioline nella soluzione.

Risospendere i PFCnD in un millilitro di PBS pipettando il pellet su e giù e quindi sonicare in un sonicatore da bagno per un minuto. Diluire il materiale PFCnD 100 volte aggiungendo 10 microlitri di materiale di PFCnD a 990 microlitri di PBS e sonicare il bagno per disperdere i PFCnD prima di misurarne le dimensioni. Misurare la dimensione delle goccioline utilizzando la diffusione dinamica della luce.

Degasare l'acqua riempiendo un pallone sottovuoto da 500 millilitri con 400 millilitri di acqua deionizzata, sigillare con un tappo di gomma e collegare il pallone alla linea del vuoto. Aprire la linea del vuoto e immergere il fondo del pallone nel sonicatore da bagno. Sonicare per cinque minuti o fino a quando non è visibile alcuna formazione di bolle di gas.

Preparare il 10% di ammonio per soluzione di solfato sciogliendo 500 milligrammi in cinque millilitri di acqua degassata. Ruotare delicatamente la soluzione se il persolfato di ammonio non si dissolve completamente. In un becher da 400 millilitri con una barra di agitazione su una piastra di agitazione, aggiungere 150 millilitri di acqua degassata e 50 millilitri di soluzione di 40 acrilammide bisacrilammide per formare 200 millilitri di soluzione di acrilammide bisacrilammide al 10%.

Mescolare la miscela a 200 RPM per consentire una corretta miscelazione senza introdurre bolle. Pesare 400 milligrammi di silice e aggiungerla alla soluzione di acrilammide bisacrilammide al 10% per formare una soluzione di silice e acrilammide allo 0,2%. Preparare uno stampo quadrato con un'inclusione cilindrica tagliando le punte da una pipetta di trasferimento di plastica e supportandolo nello stampo con nastro da laboratorio.

Aggiungere due millilitri di soluzione di persolfato di ammonio al 10% nel becher per ottenere una concentrazione finale dello 0,1% e aggiungere 250 microlitri di TEMED alla soluzione fantasma. Lasciare mescolare la soluzione per meno di un minuto. Versare rapidamente la soluzione nello stampo facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione.

La soluzione dovrebbe polimerizzare entro 10 minuti. Rimuovere il fantasma facendo scorrere l'estremità piatta di una spatola da laboratorio attorno al bordo dello stampo e invertendo lo stampo. Accendere e riscaldare il sistema laser pulsato per circa 20 minuti seguendo le istruzioni del produttore.

Assicurarsi che il fascio in fibra ottica sia collegato correttamente all'uscita laser e che le due gambe siano posizionate correttamente all'interno del supporto del fascio di fibre. Dopo aver acceso il sistema di imaging a ultrasuoni, collegare il trasduttore di imaging array al sistema e fissare il trasduttore all'interno del supporto per allineare il suo piano di imaging con la sezione trasversale laser. Impostare la frequenza di ripetizione dell'impulso del sistema laser su 10 hertz e posizionare un misuratore di potenza all'estremità del fascio di fibre per misurare l'energia.

Sintonizzare il ritardo dell'interruttore Q fino a quando la fluenza stimata è di 70 millijoule per centimetro quadrato. Riempire uno dei canali nel fantasma di poliacrilammide con il gel ad ultrasuoni e la miscela PFCnD utilizzando una siringa da un millilitro di plastica. Coprire liberamente la parte superiore del canale con gel ad ultrasuoni e rimuovere eventuali bolle con una siringa di plastica da un millilitro.

Infine, posizionare il fantasma di poliacrilammide sotto il trasduttore e il fascio di fibre. La corretta formulazione e separazione centrifuga dei PFCnD produce goccioline di circa 200-300 nanometri di diametro. La dimensione delle goccioline aumenta nel tempo a causa della coalescenza e della diffusione in un processo noto come maturazione di Ostwald.

Il contrasto rispetto all'inclusione per l'impulso finale è risultato essere circa 3,2 volte maggiore, cioè un miglioramento del 220% rispetto all'impulso P. L'area iperecogena è stata calcolata per ciascun frame e normalizzata dall'area iperecogena del primo frame e quindi adattata a un modello di decadimento esponenziale. Il tempo di decadimento caratteristico dell'area iperecogena normalizzata era fino a 3,5 volte più lungo nell'imaging a impulso N rispetto all'impulso P.

I fotogrammi dell'immagine differenziale in modalità B sono stati registrati in tempo per ogni imaging N-impulso e P-impulso. Una delle cose più importanti è espellere i lipidi sul fondo del pallone per assicurarsi che vengano incorporati correttamente nella torta lipidica.