Ablazioni di volume profonde e controllate spazialmente utilizzando un microscopio a due fotoni nella Zebrafish Gastrula

All'interno degli embrioni, le cellule interagiscono tra loro, scambiandosi informazioni chimiche e meccaniche. Un modo efficace per sondare queste interazioni è quello di uccidere alcune cellule e monitorare le conseguenze sulle cellule vicine. Il metodo che descriviamo ci consente di ablare accuratamente le cellule, anche all'interno dell'embrione, senza danneggiare i tessuti vicini.

Preparare il microscopio a due fotoni impostando il primo laser sulla lunghezza d'onda di ablazione di 820 nanometri e il secondo laser sulla lunghezza d'onda di imaging mCherry 1.160 nanometri. Utilizzando specchi mobili sul percorso ottico, allineare i due raggi laser all'ingresso e all'uscita delle teste di scansione, quindi misurare la potenza massima del primo laser a 820 nanometri. Posizionare il misuratore di potenza sotto l'obiettivo, chiudere la camera nera e impostare la prima potenza laser su 100% Avviare la raccolta dei dati sul misuratore di potenza, aprire l'otturatore laser, quindi misurare la potenza di uscita e calcolare la percentuale di potenza laser necessaria per raggiungere i 300 milliwatt.

Impostare il primo laser sulla lunghezza d'onda di eccitazione GFP di 920 nanometri e la potenza al 7% Regolare la seconda potenza laser al 15%Attivare i rilevatori PMT per linee verdi e rosse e impostare la sensibilità PMT della linea verde e rossa su 65. Regola il campo visivo a 400 x 400 micrometri, la risoluzione dell'immagine a 512 x 512 pixel e la frequenza di scansione a 800 hertz. Selezionare la modalità di imaging time lapse 3D, quindi creare una cartella e attivare il salvataggio automatico per salvare i dati dopo ogni acquisizione.

Assemblare la camera di riscaldamento e impostarla a 28 gradi Celsius. Attendere almeno 10 minuti affinché la camera e l'obiettivo si riscaldino. Sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza, identificare gli embrioni al 70% epiboly che esprimono GFP.

Utilizzando una pipetta di plastica Pasteur, trasferire tre o quattro embrioni selezionati nel piatto rivestito di agarosio e decoerniarli accuratamente con una pinza fine. In un piccolo flaconcino di vetro, aggiungere un millilitro di una soluzione di terreno embrionale penicillina-streptomicina contenente il 2% di agarosio e posizionare il flaconcino in un riscaldatore a blocchi preriscaldato e asciutto a 42 gradi Celsius. Utilizzando una pipetta di vetro lucidata a fuoco, trasferire un embrione decorionato alla fiala, facendo attenzione a non aggiungere troppo terreno embrionale all'agarosio.

Scartare il mezzo embrionale rimanente dalla pipetta. Aspirare l'embrione indietro, insieme a abbastanza agarosio per coprire il vetrino del piatto di fondo di vetro. Soffiare l'agarosio con l'embrione sul vetrino del piatto, assicurandosi che l'embrione non tocchi l'aria o il lato di plastica del piatto.

Quindi, riempire la camera attorno al vetrino con agarosio. Usando una ciglia, orientare l'embrione in modo che la regione target sia in cima. Dopo cinque minuti, quando l'agarosio è completamente impostato, aggiungere alcune gocce di terreno embrionale penicillina-streptomicina al vetrino.

Posizionare il piatto con fondo di vetro sotto l'obiettivo nella camera riscaldata. Immergere l'obiettivo nel mezzo embrionale penicillina-streptomicina prima di chiudere la camera. Spostare il dispositivo di scorrimento per impostare il percorso della luce sugli oculari.

Accendere la lampada a fluorescenza. Trova un embrione e focalizza l'attenzione sulla sua superficie. Spegnere la lampada a fluorescenza e impostare il percorso della luce verso i PMT prima di chiudere la camera nera.

Avviare l'imaging dal vivo e individuare il mesoderma assiale. Per avere un buon segnale, regola le potenze del laser. Usa il canale rosso per spostare lo stadio verso l'alto dell'embrione e assegna questa posizione come Z uguale a zero.

Scegli un passo temporale di un minuto e un passo Z di due micrometri. Impostare la prima fetta a 15 micrometri sopra il mesoderma assiale e l'ultima fetta a 15 micrometri sotto il mesoderma assiale. Registra da 10 a 15 minuti di un filmato pre-ablazione.

Nell'imaging dal vivo, individua il contorno del polster, quindi, utilizzando la regione di interesse del modulatore elettro-ottico o lo strumento EOM-ROI, disegna un rettangolo di 20 pixel che si estende per la larghezza del polster e posiziona il rettangolo al centro del polster. Si noti la posizione assiale dei piani più alto e più basso da ablare, assicurando che il ROI a non si sovrapponga alla cella del tuorlo su nessuno dei piani. Posizionare il palco nella posizione Z più bassa per essere ablato.

Impostare la prima lunghezza d'onda del laser su 820 nanometri e immettere la percentuale di potenza calcolata in precedenza per ottenere una potenza di uscita di 300 milliwatt. Impostare la frequenza di imaging su 200 hertz e il primo EOM di imaging laser su zero. Dopo aver selezionato la modalità ROI Treat, disattivare l'EOM e impostare il trattamento in modo che inizi immediatamente dopo zero frame.

Metti la modalità di imaging su Timelapse e disattiva il salvataggio automatico. Dopo aver selezionato la modalità Veloce nel passo Tempo, regolate il numero di fotogrammi di trattamento e il numero di fotogrammi in base al valore corrispondente alla profondità di destinazione. Avviare l'imaging.

L'acquisizione deve essere nera, poiché l'otturatore di PMT si chiude durante il trattamento EOM. Quindi, sposta il palco nella successiva posizione Z ed esegui in modo simile l'ablazione. Ripetere su ogni posizione Z fino a raggiungere la parte superiore del polster.

Quando il processo di ablazione è completo, impostare il primo laser su 920 nanometri e adattarsi alla potenza di imaging scelta in precedenza. Metti il primo EOM di imaging laser a 100 e opta per la modalità Full field. La frequenza di imaging dovrebbe essere di 800 hertz e l'EOM dovrebbe essere spento prima di esaminare l'intero stack in modalità live per verificare se ogni aereo è stato ablato.

Una volta confermata l'ablazione, selezionare Time lapse 3D come modalità di imaging. Riattiva il salvataggio automatico e inizia a registrare il filmato post ablazione per 40-60 minuti. Nel filmato post-ablazione, controlla se le cellule bersaglio sono state effettivamente ablate.

Poiché le ablazioni attraverso i polster non dovrebbero danneggiare gli embrioni, la normale morfologia degli embrioni ablati può essere osservata fino a 24 ore dopo la fecondazione. Nel risultato positivo delle ablazioni laser, i tessuti sovrapposti non sono stati influenzati dall'ablazione delle strutture sottostanti. Un trattamento troppo intenso, o troppo poco, ha provocato fallimenti nell'ablazione laser.

Un esempio di ablazione infruttuosa mostra che le cellule sopra il polster sono ablate, il che era evidente dai detriti autofluorescenti nel piano focale sopra il polster. In un altro tentativo inefficace, le cellule sono state sbiancate ma non ablate e i segnali a bassa fluorescenza rivelano ancora i contorni cellulari intatti. Infine, alcune cellule non sono state nemmeno sbiancate a causa di un trattamento laser insufficiente.

La formazione di bolle è dovuta alla cavitazione indotta da un trattamento laser troppo intenso. Gli Z-stack sono stati catturati ogni minuto per 40 minuti in un'ablazione riuscita, registrando sia la GFP citoplasmatica che i segnali mCherry nucleari. Inoltre, i nuclei appartenenti alla metà anteriore del polster sono contrassegnati con un punto magenta e tracciati nel tempo, prima e dopo l'ablazione.

Come misura della persistenza della migrazione, è stata studiata l'auto-correlazione di direzione delle cellule prima e dopo l'ablazione. Le cellule appartenenti alla parte anteriore del polster hanno mostrato un movimento persistente prima dell'ablazione, che diminuisce drasticamente dopo l'ablazione, indicando una perdita di migrazione orientata collettiva. Allineare correttamente i laser e misurare la potenza del laser sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili.

È anche fondamentale verificare l'efficienza dell'ablazione sulle prime immagini post-ablazione. Usiamo le ablazioni laser per mettere in discussione il ruolo delle interazioni cellula-cellula nel guidare la migrazione delle cellule all'interno dell'embrione. Ma la procedura potrebbe essere facilmente adattata a molte altre domande in cui le cellule o i tessuti devono essere ablati con precisione, potenzialmente in profondità nell'organismo.