Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120
19 agosto 2021
L'optogenetica è uno strumento potente con applicazioni ad ampio raggio. Questo protocollo dimostra come ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu.
Questo protocollo è significativo perché è un metodo optogenetico, o attivato dalla luce, per indurre l'espressione genica, in un organismo intatto. Nel nostro caso, un embrione di zebrafish. Il vantaggio di questa tecnica, è che utilizza la luce, come agente induttore, che consente un controllo molto preciso, spaziale e temporale dell'induzione.
Questo protocollo sarebbe utile per qualsiasi situazione in cui l'espressione genica inducibile sarebbe utile. Ciò include cose come il tracciamento del lignaggio, i saggi di guadagno di funzione o gli esperimenti di salvataggio. Per iniziare posiziona il pannello LED rispetto alle piastre di Petri contenenti embrioni per fornire 1,5 milliwatt per centimetro quadrato di potenza di luce a più embrioni contemporaneamente.
Per ridurre il rischio di danni fotografici all'attivatore trascrizionale della coda, inviare la luce a intervalli di un'ora on-off utilizzando un relè timer, se si illumina per più di tre ore. Rimuovere i coperchi della capsula di Petri per ridurre al minimo la dispersione della luce dalla condensa. Posizionare le piastre di Petri contenenti embrioni di controllo e una scatola a prova di luce per i controlli scuri.
Rimuovere gli embrioni dall'illuminazione, dopo la durata di attivazione desiderata. Per l'estrazione totale dell'RNA, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA. Trasferire gli embrioni in un tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri e rimuovere l'acqua dell'uovo in eccesso.
Dopo aver aggiunto il tampone di lisi, omogeneizzare gli embrioni con il pestello di plastica. Trasferire il lisiato in una colonna fornita dal kit e seguire le istruzioni del produttore per purificare l'RNA. Conservare l'RNA purificato, a meno 20 a meno 80 gradi Celsius, fino all'uso o sintetizzare immediatamente il cDNA da un microgrammo, RNA totale utilizzando il kit di sintesi del cDNA, seguendo le istruzioni del produttore.
Aggiungere un microgrammo di RNA in una parete sottile da 0,2 millilitri, tubo PCR, contenente quattro microlitri, di cinque volte la miscela master di reazione cDNA, seguita dall'aggiunta di un microlitro, di 20 volte soluzione enzimatica di trascrittasi inversa. Successivamente compongono un volume finale di 20 microlitri, con acqua priva di nucleasi. Posizionare il tubo in un termocicclatore programmato per la sintesi del cDNA.
Conservare il cDNA sintetizzato a meno 20 gradi Celsius fino all'uso o utilizzare immediatamente per la valutazione quantitativa. Impostare le reazioni quantitative PCR contenenti cyber green enzyme master mix. CDNA e GFP primer a 325 nanomolari a 325 nanomolari in triplicati e conducono la reazione in una macchina PCR programmata in tempo reale.
Al termine della reazione, analizzare la curva di fusione per determinare la specificità della reazione. Calcola l'induzione attivata dalla luce come cambiamento di piega rispetto agli embrioni di controllo utilizzando il metodo della doppia TC Delta. E utilizzare software statistico per determinare la significatività.
Dopo aver rimosso gli embrioni dall'illuminazione, immobilizzare gli embrioni per l'imaging in 3% di metilcellulosa contenente lo 0,01% di tricaina in vetrini di depressione di vetro. Acquisisci immagini a fluorescenza e in campo luminoso su uno stereomicroscopio fluorescente collegato a una fotocamera digitale utilizzando le impostazioni standard del filtro GFP. Unisci immagini brightfield e fluorescenza dopo l'acquisizione con il software di elaborazione delle immagini.
La quantificazione dell'espressione GFP indicava l'induzione dell'espressione non appena 30 minuti dopo l'esposizione alla luce blu. I livelli di espressione della GFP hanno poi continuato ad aumentare fino a sei ore, post-attivazione costantemente. L'induzione della GFP è stata anche valutata qualitativamente esaminando l'intensità della fluorescenza nei punti di tempo post-attivazione.
La fluorescenza della GFP al di sopra dei livelli di fondo è stata osservata per la prima volta a tre ore dopo l'attivazione ed è diventata notevolmente più luminosa a sei ore dopo l'attivazione. Al contrario, gli embrioni di controllo per tutti i punti temporali, tenuti al buio, non mostravano alcuna apprezzabile fluorescenza GFP. La luce attivante deve essere nell'intervallo blu dello spettro della luce visibile.
Sia la luce della stanza che la luce del sole contengono un po 'di luce blu. Quindi fai attenzione a proteggere i tuoi controlli negativi da qualsiasi fonte di luce ambientale. Il sistema TAEL C120, è geneticamente codificato e modulare e può guidare l'espressione di qualsiasi gene di interesse.
Quindi, combinato con altre tecniche, può essere utilizzato per rispondere a una serie di domande biologiche.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra l'uso dell'optogenetica per ottenere un'espressione genica inducibile alla luce in embrioni di pesce zebra. Il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu permette un controllo preciso dell'espressione genica in un organismo integro.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Optogenetica
- Espressione genica
- Modelli di pesce zebra
Sfondo
- La optogenetica è un metodo attivato dalla luce per indurre l'espressione genica.
- Questa tecnica fornisce un controllo spaziale e temporale dell'induzione.
- È particolarmente utile per il tracciamento della linea cellulare e per saggi di acquisizione di funzione.
- Gli embrioni di pesce zebra costituiscono un modello per lo studio dell'espressione genica in vivo.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo per l'espressione genica inducibile alla luce.
- Fornire un protocollo per ricercatori interessati ad applicazioni optogenetiche.
- Facilitare esperimenti che richiedono un controllo preciso dell'espressione genica.
Metodi Utilizzati
- Posizionamento di un pannello LED rispetto a piastre di Petri contenenti embrioni.
- Erogazione di 1,5 milliwatt per centimetro quadrato di luce.
- Induzione dell'espressione genica in più embrioni contemporaneamente.
- Utilizzo del sistema optogenetico TAEL/C120 per il controllo genico.
Risultati principali
- Induzione riuscita dell'espressione genica in embrioni di zebrafish.
- Dimostrato un controllo spaziale e temporale sull'attivazione genica.
- Fornito un protocollo affidabile per futuri studi optogenetici.
- Evidenziati i vantaggi dell'uso della luce come agente induttore.
Conclusioni
- La optogenetica offre uno strumento potente per lo studio della funzione genica.
- Il sistema TAEL/C120 è efficace nell'indurre l'espressione genica in vivo.
- Questo metodo può essere applicato a diverse situazioni di ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il controllo optogenetico dell'espressione genica consente un'indagine precisa degli elementi biologici bersaglio in termini spaziotemporali in vivo, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase iniziale di scoperta. Il sistema TAEL/C120 fornisce una piattaforma geneticamente codificabile e attivabile tramite luce per la validazione di ipotesi terapeutiche con letture quantitative. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella validazione del bersaglio, permettendo una modulazione reversibile e dipendente dalla dose dell'espressione genica negli embrioni di zebrafish.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante l'attivazione genica indotta e reversibile in un modello vertebrale integro.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio collegando l'espressione indotta dalla luce a letture fenotipiche tramite reporter GFP e quantificazione con qRT-PCR.
- Valore predittivo: Facilita esperimenti di tipo gain-of-function e di recupero fenotipico per valutare la sufficienza del bersaglio e la sua rilevanza nel percorso biologico in contesti pertinenti alla malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera un'espressione quantitativa di GFP dipendente dalla luce, misurabile mediante microscopia a fluorescenza e qRT-PCR, per lo screening di composti o condizioni.
- Riproducibilità: Permette protocolli di induzione standardizzati con intensità luminosa definita (1,5 mW/cm²) e controllo temporale, riducendo al minimo la variabilità tra ripetizioni.
- Scalabilità: Compatibile con formati a pozzetti multipli mediante l'uso di pannelli LED per trattare simultaneamente più embrioni sotto illuminazione controllata.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Modellazione delle Malattie: Supporta modelli preclinici basati sul pesce zebra in cui il controllo temporale dell'espressione genica imita interventi terapeutici induttibili.
- Allineamento dei Biomarcatori: I risultati ottenuti con GFP e qRT-PCR fungono da letture farmacodinamiche trasferibili per la partecipazione del percorso e la modulazione del bersaglio.
- riduzione del rischio: Permette di ridurre i rischi associati ai bersagli testandone la necessità e la sufficienza mediante disegni induttibili di tipo gain-of-function e di recupero prima degli studi nei mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione di un composto promettente, consentendo una validazione iterativa dei bersagli molecolari in un sistema vertebrale.
- Biologia della scoperta: Verifica la sufficienza del bersaglio e l'attivazione del percorso attraverso l'espressione indotta dalla luce in tempi controllati in vivo.
- Screening: Fornisce output quantitativi e normalizzati (variazione del GFP espresso) per confrontare condizioni genetiche o farmacologiche.
- Analisi: Utilizza la qRT-PCR con metodo delta delta CT e l'intensità di fluorescenza per il confronto statistico tra campioni indotti e controlli al buio.
- Ricerca traslazionale: Collega l'espressione indotta agli esiti fenotipici nel pesce zebra, favorendo la transizione verso test preclinici di efficacia.
- Riutilizzo aziendale: Il sistema modulare TAEL/C120 può esprimere qualsiasi gene di interesse, consentendone il riutilizzo su più bersagli e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo un controllo temporale preciso sull'espressione genica in un organismo complesso.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso una somministrazione standardizzata della luce e controlli interni in condizioni di buio per tenere conto della variabilità ambientale.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione sperimentale consentendo una modulazione rapida e reversibile del bersaglio per valutarne le conseguenze fenotipiche.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio validando i bersagli in un sistema fisiologicamente rilevante e inducibile prima di procedere con investimenti intensivi di risorse.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'allevamento di zebrafish, microiniezione e configurazione dell'apparato optogenetico.
- È subordinato a sistemi di illuminazione a LED in grado di fornire un controllo preciso dell'intensità e della temporizzazione della luce blu.
- Necessita di protocolli standardizzati per la durata dell'esposizione alla luce e per il mantenimento del controllo in condizioni di buio, al fine di garantire la confrontabilità dei dati.
- Comporta considerazioni adattative quando si passa a stadi embrionali diversi o a diversi background genetici.
- È limitato dalla penetrazione della luce nei tessuti opachi, sebbene tale limite sia attenuato negli embrioni di zebrafish grazie alla loro trasparenza ottica.
