Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120
August 19th, 2021
L'optogenetica è uno strumento potente con applicazioni ad ampio raggio. Questo protocollo dimostra come ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu.
Questo protocollo è significativo perché è un metodo optogenetico, o attivato dalla luce, per indurre l'espressione genica, in un organismo intatto. Nel nostro caso, un embrione di zebrafish. Il vantaggio di questa tecnica, è che utilizza la luce, come agente induttore, che consente un controllo molto preciso, spaziale e temporale dell'induzione.
Questo protocollo sarebbe utile per qualsiasi situazione in cui l'espressione genica inducibile sarebbe utile. Ciò include cose come il tracciamento del lignaggio, i saggi di guadagno di funzione o gli esperimenti di salvataggio. Per iniziare posiziona il pannello LED rispetto alle piastre di Petri contenenti embrioni per fornire 1,5 milliwatt per centimetro quadrato di potenza di luce a più embrioni contemporaneamente.
Per ridurre il rischio di danni fotografici all'attivatore trascrizionale della coda, inviare la luce a intervalli di un'ora on-off utilizzando un relè timer, se si illumina per più di tre ore. Rimuovere i coperchi della capsula di Petri per ridurre al minimo la dispersione della luce dalla condensa. Posizionare le piastre di Petri contenenti embrioni di controllo e una scatola a prova di luce per i controlli scuri.
Rimuovere gli embrioni dall'illuminazione, dopo la durata di attivazione desiderata. Per l'estrazione totale dell'RNA, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA. Trasferire gli embrioni in un tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri e rimuovere l'acqua dell'uovo in eccesso.
Dopo aver aggiunto il tampone di lisi, omogeneizzare gli embrioni con il pestello di plastica. Trasferire il lisiato in una colonna fornita dal kit e seguire le istruzioni del produttore per purificare l'RNA. Conservare l'RNA purificato, a meno 20 a meno 80 gradi Celsius, fino all'uso o sintetizzare immediatamente il cDNA da un microgrammo, RNA totale utilizzando il kit di sintesi del cDNA, seguendo le istruzioni del produttore.
Aggiungere un microgrammo di RNA in una parete sottile da 0,2 millilitri, tubo PCR, contenente quattro microlitri, di cinque volte la miscela master di reazione cDNA, seguita dall'aggiunta di un microlitro, di 20 volte soluzione enzimatica di trascrittasi inversa. Successivamente compongono un volume finale di 20 microlitri, con acqua priva di nucleasi. Posizionare il tubo in un termocicclatore programmato per la sintesi del cDNA.
Conservare il cDNA sintetizzato a meno 20 gradi Celsius fino all'uso o utilizzare immediatamente per la valutazione quantitativa. Impostare le reazioni quantitative PCR contenenti cyber green enzyme master mix. CDNA e GFP primer a 325 nanomolari a 325 nanomolari in triplicati e conducono la reazione in una macchina PCR programmata in tempo reale.
Al termine della reazione, analizzare la curva di fusione per determinare la specificità della reazione. Calcola l'induzione attivata dalla luce come cambiamento di piega rispetto agli embrioni di controllo utilizzando il metodo della doppia TC Delta. E utilizzare software statistico per determinare la significatività.
Dopo aver rimosso gli embrioni dall'illuminazione, immobilizzare gli embrioni per l'imaging in 3% di metilcellulosa contenente lo 0,01% di tricaina in vetrini di depressione di vetro. Acquisisci immagini a fluorescenza e in campo luminoso su uno stereomicroscopio fluorescente collegato a una fotocamera digitale utilizzando le impostazioni standard del filtro GFP. Unisci immagini brightfield e fluorescenza dopo l'acquisizione con il software di elaborazione delle immagini.
La quantificazione dell'espressione GFP indicava l'induzione dell'espressione non appena 30 minuti dopo l'esposizione alla luce blu. I livelli di espressione della GFP hanno poi continuato ad aumentare fino a sei ore, post-attivazione costantemente. L'induzione della GFP è stata anche valutata qualitativamente esaminando l'intensità della fluorescenza nei punti di tempo post-attivazione.
La fluorescenza della GFP al di sopra dei livelli di fondo è stata osservata per la prima volta a tre ore dopo l'attivazione ed è diventata notevolmente più luminosa a sei ore dopo l'attivazione. Al contrario, gli embrioni di controllo per tutti i punti temporali, tenuti al buio, non mostravano alcuna apprezzabile fluorescenza GFP. La luce attivante deve essere nell'intervallo blu dello spettro della luce visibile.
Sia la luce della stanza che la luce del sole contengono un po 'di luce blu. Quindi fai attenzione a proteggere i tuoi controlli negativi da qualsiasi fonte di luce ambientale. Il sistema TAEL C120, è geneticamente codificato e modulare e può guidare l'espressione di qualsiasi gene di interesse.
Quindi, combinato con altre tecniche, può essere utilizzato per rispondere a una serie di domande biologiche.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra l'uso dell'optogenetica per ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish. Il sistema TAEL/C120 reattivo alla luce blu permette un controllo preciso dell'espressione genica in un organismo intero.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Optogenetica
- Espressione genica
- Modelli di zebrafish
Sfondo
- L'optogenetica è un metodo attivato dalla luce per indurre l'espressione genica.
- Questa tecnica fornisce un controllo spaziale e temporale dell'induzione.
- È particolarmente utile per il tracciamento della linea cellulare e gli assay di gain-of-function.
- Gli embrioni di zebrafish servono come modello per studiare l'espressione genica in vivo.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare un metodo per l'espressione genica inducibile dalla luce.
- Fornire un protocollo per i ricercatori interessati alle applicazioni optogenetiche.
- Facilitare esperimenti che richiedono un controllo preciso sull'espressione genica.
Metodi utilizzati
- Posizionamento di un pannello LED rispetto alle piastre di Petri contenenti gli embrioni.
- Erogazione di 1,5 milliwatt per centimetro quadrato di luce.
- Induzione dell'espressione genica in più embrioni contemporaneamente.
- Utilizzo del sistema optogenetico TAEL/C120 per il controllo genico.
Risultati principali
- Induzione riuscita dell'espressione genica negli embrioni di zebrafish.
- Controllo spaziale e temporale dimostrato sull'attivazione genica.
- Fornito un protocollo affidabile per futuri studi optogenetici.
- Evidenziato i vantaggi dell'uso della luce come agente induttore.
Conclusioni
- L'optogenetica offre uno strumento potente per studiare la funzione genica.
- Il sistema TAEL/C120 è efficace per indurre l'espressione genica in vivo.
- Questo metodo può essere applicato a vari scenari di ricerca biologica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Optogenetic control of gene expression enables precise spatiotemporal interrogation of biological targets in vivo, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The TAEL/C120 system provides a genetically encoded, light-switchable platform for validating therapeutic hypotheses with quantitative readouts. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing reversible, dose-dependent modulation of gene expression in zebrafish embryos.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through inducible, reversible gene activation in an intact vertebrate model.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking light-induced expression to phenotypic readouts via GFP reporter and qRT-PCR quantification.
- Predictive Value: Facilitates gain-of-function and rescue experiments to assess target sufficiency and pathway relevance in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, light-dependent GFP expression measurable by fluorescence microscopy and qRT-PCR for compound or condition screening.
- Reproducibility: Enables standardized induction protocols with defined light intensity (1.5 mW/cm²) and temporal control to minimize variability across replicates.
- Scalability: Compatible with multi-well formats using LED panels to treat multiple embryos simultaneously under controlled illumination.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Supports zebrafish-based preclinical models where temporal control of gene expression mimics inducible therapeutic interventions.
- Biomarker Alignment: GFP and qRT-PCR outputs serve as translatable pharmacodynamic readouts for pathway engagement and target modulation.
- Risk Mitigation: Allows de-risking of targets by testing necessity and sufficiency through inducible gain-of-function and rescue designs prior to mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, enabling iterative validation of molecular targets in a vertebrate system.
- Discovery Biology: Tests target sufficiency and pathway activation through timed, light-induced expression in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, normalized outputs (fold-change GFP) for comparing genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs double delta CT qRT-PCR and fluorescence intensity for statistical comparison between induced and dark controls.
- Translational Research: Connects inducible expression to phenotypic outcomes in zebrafish, supporting continuity to preclinical efficacy testing.
- Enterprise Reuse: Modular TAEL/C120 system can drive any gene of interest, enabling reuse across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing precise temporal control over gene expression in a complex organism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized light delivery and internal dark controls to account for environmental variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid, reversible target modulation to assess phenotypic consequences.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating targets in a physiologically relevant, inducible system before resource-intensive advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and optogenetic hardware setup.
- Depends on LED illumination systems capable of delivering precise blue light intensity and timing control.
- Necessitates standardized protocols for light exposure duration and dark control maintenance to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when scaling to different embryonic stages or genetic backgrounds.
- Limited by light penetration in opaque tissues, though mitigated in zebrafish embryos due to optical clarity.
