Controlli dell'antigene sintetico per l'immunoistochimica

I gel antigenici BSA sono standard IHC riproducibili ben caratterizzati che possono integrare i controlli esistenti. Questo protocollo utilizza istologia standard e reagenti e metodi IHC per rendere riproducibili standard di composizione nota. Questi controlli offrono l'opportunità a diversi laboratori di calibrare e standardizzare i saggi IHC per molti test diagnosticamente rilevanti.

È importante trovare un solvente adatto per sciogliere il peptide o la proteina. Può essere difficile mescolare rapidamente soluzioni di antigene e formaldeide senza introdurre bolle. Per iniziare, preparare 20 millilitri di una soluzione BSA al 25% peso in volume mescolando cinque grammi di polvere BSA in 14 millilitri di PBS, in un tubo conico da 50 millilitri fino a distribuzione uniforme.

Vortex la soluzione per sciogliere la polvere BSA. Mantenere la soluzione durante la notte a quattro gradi Celsius per una completa dissoluzione. Il giorno seguente, regolare il volume finale a 20 millilitri con PBS.

Allo stesso modo, preparare 20 millilitri di una soluzione BSA al 31,3% peso in volume mescolando 6,26 grammi di polvere BSA in 13 millilitri di PBS. Dopo l'incubazione notturna per la completa dissoluzione, regolare il volume finale a 20 millilitri con PBS. Per verificare che la miscela di formaldeide BSA formi un gel, preriscaldare un blocco di calore a 85 gradi Celsius.

Quindi mescolare 700 microlitri della soluzione al 25% BSA con 700 microlitri di formaldeide al 37%. Mescolare bene pipettando su e giù cinque volte entro cinque-10 secondi senza creare bolle d'aria. Immediatamente dopo la miscelazione, posizionare il tubo di microcentrifuga chiuso nel blocco termico preriscaldato a 85 gradi Celsius.

Dopo 10 minuti, rimuovere il tubo dal blocco termico. Lasciare raffreddare e confermare che il gel si è formato come previsto. Preparare ed etichettare chiaramente otto tubi da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi preparare una soluzione madre di peptide 5x, aggiungere una concentrazione di 12,5 millimolari risospendendo l'intera massa del peptide liberalizzato in 60 microlitri del solvente appropriato. Osservare la soluzione per assicurarsi che il peptide sia completamente dissolto. Quindi aggiungere un ulteriore volume di solvente se necessario per ottenere una soluzione da 12,5 millimolari in base al peso molecolare dei peptidi, alla massa e alla purezza.

In questo esempio, lo stock di peptidi 5x ha un volume finale di 626,9 microlitri. Altri campioni di peptidi richiederanno un volume finale diverso. Quindi, preparare 150 microlitri di una soluzione madre di peptide 1x aggiungere una concentrazione di 2,5 millimolari diluendo 30 microlitri dello stock di peptidi 5x in 120 microlitri di solvente.

Vortice la soluzione per cinque secondi e centrifugare a temperatura ambiente. Quindi, preparare 700 microlitri di una soluzione di peptide BSA 0,5 millimolare diluendo 140 microlitri dello stock di peptidi 1x in 560 microlitri della soluzione BSA al 31,3%. Dopo il vortice, centrifugare la soluzione a temperatura ambiente.

Allo stesso modo, preparare quattro successive diluizioni seriali 10x del calcio peptidico BSA aggiungendo 70 microlitri della soluzione peptidica BSA a 630 microlitri della soluzione di BSA al 25%. Per preparare i gel peptidici BSA, aggiungere il 37% di formaldeide alle diluizioni peptidiche BSA in un rapporto uno a uno lavorando un campione alla volta. Mescolare bene pipettando su e giù cinque volte entro cinque-10 secondi senza creare bolle d'aria.

Dopo la miscelazione, posizionare il tubo di microcentrifuga chiuso in un blocco termico a 85 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo che tutte le soluzioni di peptide BSA e formaldeide sono state preparate e riscaldate, lasciare raffreddare i gel sul banco per cinque o 10 minuti. Successivamente, utilizzando una spatola da laboratorio usa e getta pulita e flessibile, rimuovere il campione di gel dal tubo della microcentrifuga in un unico pezzo.

E metterlo in un contenitore sigillato contenente almeno 15 millilitri di formalina tamponata neutra, utilizzando un contenitore separato per ciascun campione. In alternativa, utilizzando una nuova lama a filo singolo, tagliare il fondo del tubo della microcentrifuga e spingere il gel fuori dal fondo con aria o una sonda adatta. Utilizzando un rasoio pulito a taglio singolo, tagliare il cono di gel in dischi cilindrici di circa cinque millimetri di spessore.

Dopo aver avvolto i dischi in un involucro per biopsia, posizionare un disco di gel più grande in una cassetta e i dischi di gel rimanenti insieme in una seconda cassetta per l'uso nella costruzione di microarray tissutali. Prima della lavorazione, posizionare i gel della cassetta in almeno 15 millilitri di formalina tamponata neutra al 10% per gel, utilizzando un contenitore separato per ciascun campione. Successivamente, elaborare i gel in un processore tissutale istologico automatizzato seguendo un ampio programma di tessuti con pressione e vuoto.

Al termine dell'elaborazione del campione, rimuovere le cassette dal processore di tessuti e spostarle nel centro di incorporazione della paraffina. Dopo aver scartato i gel dall'involucro della biopsia, incorporare i gel in paraffina o ogni campione incorporare un disco di gel in un piccolo stampo da 15 per 15 millimetri. E i dischi di gel rimanenti insieme in un secondo stampo più grande.

Per ogni serie di diluizione peptidica, creare due vetrini contenenti un totale di sei sezioni separate. Una sezione da ciascuno dei cinque campioni della serie di diluizione e una sezione dal campione di controllo negativo BSA. Dopo aver sezionato e asciugato i vetrini, colorare i due vetrini preparati per ciascun peptide con l'anticorpo primario desiderato.

Secondo i protocolli standard di immunoistochimica ci si aspetta di vedere un segnale relativamente uniforme all'interno di ogni sezione di gel. Con i diversi campioni di gel che mostrano un intervallo di intensità del segnale corrispondente alle diluizioni peptidiche. Per la costruzione del microarray di tessuto gel BSA, tagliare sezioni spesse quattro micrometri del microarray tissutale e colorare con un anticorpo monoclonale di coniglio secondo i protocolli standard di laboratorio.

Valutare qualitativamente l'intensità della macchia risultante mediante ispezione o acquistare quantitativamente la scansione e l'analisi delle immagini digitali. Dopo aver reagito con gli anticorpi appropriati, i campioni di gel BSA di controllo negativo hanno mostrato un segnale minimo. L'intensità del segnale in un singolo campione di gel è relativamente uniforme e aumenta con l'aumentare delle concentrazioni di antigene.

Più del 10% delle cellule MDA-MB-175 mostra una colorazione membranosa debole e completamente circonferenziale. Al contrario, più del 10% delle cellule SKBR-3, mostrano un'intensa colorazione membranosa completamente circonferenziale Lavorare rapidamente una volta aggiunta la formaldeide perché le soluzioni inizieranno a gelificare anche a temperatura ambiente. Usiamo questo metodo per effettuare controlli IHC durante il test di nuovi anticorpi per darci la certezza che il test ha funzionato come previsto, anche quando gli anticorpi del test non mostrano alcun segnale.

I controlli dei tessuti o delle linee cellulari sono intrinsecamente variabili. I controlli sintetici dell'antigene ci consentono di misurare l'effetto del cambiamento di specifiche condizioni di reazione ISD in modo più preciso.