Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

Recentemente, i cheratinociti orali hanno attirato l'attenzione a causa della loro proprietà unica. Forniamo un protocollo per la coltura di cheratinociti orali di topo in uno stato simile a una cellula staminale adatto per applicazioni a valle. La coltura di cheratinociti orali di topo e caratteristiche diverse dai cheratinociti cutanei.

In questo protocollo, abbiamo isolato con successo i cheratinociti orali primari di topo e sviluppato una tecnica di coltura a lungo termine. Questo sistema di coltura può essere impiegato in saggi molecolari e biochimici per comprendere ulteriormente la caratteristica delle cellule staminali basilari orali e le loro malattie correlate. Dopo aver sacrificato un topo adulto C57BLK6J, rimuovere i peli intorno alla bocca con un rasoio e usando le forbici, tagliare dalle guance verso la mascella su entrambi i lati.

Successivamente, utilizzare una pinza per aprire la bocca e assorbire il sangue utilizzando un batuffolo di cotone, quindi disinfettare la tavolozza pulendo l'interno della bocca con un batuffolo di cotone contenente il 10% di iodio povidone. Per raccogliere la tavolozza del topo, prima usando una lama chirurgica del bisturi, fare un'incisione marginale a tutto spessore lungo il lato della tavolozza dei denti mascellari. Quindi usando un raspatorium, sezionare attentamente l'intera tavolozza.

Trasferire rapidamente il tessuto della tavolozza in un tubo da 15 millilitri contenente quattro millilitri di mezzo completo integrato con antibiotici e antimicotici. Mantenere i tessuti sul ghiaccio fino a quando non sono pronti per l'incubazione. In una cappa a flusso laminare, trasferire i tessuti in un piatto da 60 millimetri contenente quattro millilitri di mezzo completo con antibiotici e antimicotici.

Quindi, utilizzando una pinza corta e una lama di bisturi, rimuovere delicatamente il sangue dai tessuti e lavare i tessuti 10 volte con il mezzo completo. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i tessuti in un piatto da 35 millimetri contenente quattro millilitri di tripsina allo 0,025% integrata con antibiotici e antimicotici. Posizionare i tessuti con la superficie epiteliale rivolta verso il basso e incubarli per 16 ore a temperatura ambiente nella cappa di coltura.

Dopo la digestione notturna della tripsina, utilizzare un paio di pinze smussate per rimuovere il tessuto dalla soluzione di tripsina e trasferirlo in un piatto da 60 millimetri contenente una soluzione di inibitore della tripsina con la superficie epiteliale rivolta verso l'alto. Successivamente, aggrappandosi al bordo della tavolozza con una pinza, utilizzare la lama del bisturi per raschiare delicatamente lo strato epiteliale dalla lamina propria sottostante. Per raccogliere la quantità massima di cellule epiteliali dai tessuti, trasferire il tessuto in un altro piatto da 60 millimetri con quattro millilitri di mezzo completo e ripetere la raschiatura come dimostrato in precedenza.

Quindi, posizionare un filtro cellulare sterile da 100 micron sopra un tubo conico da 50 millilitri. E usando una pipetta sterile, trasferire due millilitri di soluzione di tripsina nel filtro per bagnarne la superficie. Quindi, utilizzando una pipetta, mescolare la sospensione cellulare nel piatto da 60 millimetri un paio di volte e filtrare le cellule attraverso il filtro cellulare da 100 micron.

Per contare il numero di cellule, aggiungere 15 microlitri della sospensione cellulare a 50 microlitri di soluzione blu di tripano, quindi trasferire 10 microlitri della miscela blu di tripano cellulare in un emocitometro e contare il numero di cellule. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare, rimuovere il surnatante e aggiungere due millilitri di mezzo completo contenente Chelex FBS al tubo. Risospesso il pellet cellulare titolando più volte utilizzando una pipetta da cinque millilitri.

Quindi placcare da due a cinque volte 10 alle quinte cellule da un topo in un pozzetto di piastra a 24 pozzetti pre-rivestita con collagene di tipo uno e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due giorni senza cambiare il mezzo. I cheratinociti orali primari crescevano come un monostrato e mostravano una morfologia di ciottoli. Piccole colonie di cheratinociti erano visibili dopo tre e cinque giorni.

Dopo una settimana di incubazione, queste colonie sono diventate più grandi e hanno formato colonie strette. Il primo passaggio è stato eseguito due settimane dalla placcatura iniziale e nei passaggi successivi, i cheratinociti hanno mostrato una crescita stabile con un periodo di coltura più breve. I cheratinociti hanno smesso di crescere se si è verificata una significativa contaminazione da fibroblasti durante il processo di isolamento.

Dopo la coltura, i cheratinociti hanno espresso cheratina 14 e alfa6-integrina. Le cellule di passaggio precoce e tardivo hanno mostrato un'espressione uniforme di P63 confermando la loro staminalità. Tuttavia, i cheratinociti trattati con calcio elevato hanno mostrato una diminuzione dell'espressione di P63 indicando che il trattamento ad alto contenuto di calcio sopprime i geni correlati alle cellule staminali.

Il marcatore di differenziazione cheratina 13 ha mostrato un'espressione rara o assente nei passaggi precoci e tardivi, ma un'espressione significativa nel trattamento ad alto contenuto di calcio. Il marcatore dei fibroblasti PDGFR alfa non è stato espresso nella coltura dei cheratinociti, indicando che questo protocollo potrebbe isolare con successo i cheratinociti basali e mantenere queste cellule nello stato indifferenziato. L'intrappolamento dovrebbe iniziare dal lato epidurale e 10 minuti per campione di tessuto.

Inoltre, in generale, il pipettaggio delle cellule è importante per una migliore vitalità cellulare. Dopo due o tre passaggi, i cheratinociti orali diventano stabili per ulteriori esperimenti funzionali. È importante sottolineare che questo protocollo può essere combinato con la vita transgenica del topo per il saggio cellulare e molecolare in vitro.

Recenti studi hanno riportato la dinamica e l'eterogeneità delle cellule staminali basilari orali. Questo metodo faciliterà lo studio della biologia delle cellule staminali orali e porterà a una migliore comprensione delle malattie orali.