Imaging e analisi automatizzati per la quantificazione di macropinosomi marcati fluorescentemente

La macropinocitosi è una via endocitica che è importante per una varietà di processi cellulari, incluso il metabolismo del cancro. Questo protocollo consente di quantificare l'entità della macropinocitosi nelle cellule in vitro. L'automazione è finalizzata a massimizzare la riproducibilità, la produttività e ridurre le variazioni sperimentali.

Inoltre, la microscopia fluorescente consente di ispezionare visivamente il campione per determinare la qualità sperimentale e valutare ulteriori caratteristiche dei macropinosomi. A dimostrare la procedura con me sarà Cheska Marie Galapate, un'assistente di ricerca del mio laboratorio. Per la piastra a 24 pozzetti con formato coverslip, utilizzare una pinza per afferrare un singolo coverslip dal bagno di etanolo.

Toccare il coperchio alla parete interna della piastra per rimuovere l'etanolo in eccesso e posizionare il coperchio piatto sul fondo del pozzo. Dopo che l'etanolo evapora, lavare il coverslip due volte con DPBS, quindi seminare le cellule sopra il coverslip aggiungendo 500 microlitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto. Posizionare le cellule in un incubatore cellulare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino a quando la confluenza cellulare raggiunge il 60-80% il giorno prima dell'etichettatura dei macropinosomi.

Il giorno prima dell'etichettatura dei macropinosomi, sostituire i media nei pozzetti con 500 microlitri di mezzi preriscaldati senza siero e posizionare le cellule nell'incubatore per 16-24 ore. Per il formato micropiastra a 96 pozzetti, iniziare trasferendo la sospensione cellulare in un serbatoio di reagente da 25 millilitri. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, seminare 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una micropiastra di screening nera ad alto contenuto a 96 pozzetti con un'olefina ciclica otticamente chiara o un fondo di vetro.

Incubare le cellule fino a quando la confluenza cellulare raggiunge il 60-80% il giorno prima dell'etichettatura dei macropinosomi. Il giorno prima dell'etichettatura dei macropinosomi, rimuovere e scartare il supporto da ciascun pozzo utilizzando un adattatore di aspirazione multicanale per punte standard collegate a una pompa per vuoto. In alternativa, è possibile utilizzare una pipetta multicanale.

Utilizzando un serbatoio di reagenti e una pipetta multicanale, aggiungere delicatamente 100 microlitri di supporti preriscaldati senza siero a ciascun pozzetto, quindi posizionare le cellule nell'incubatore cellulare per 16-24 ore. Per la piastra a 24 pozzetti con formato coverslip, sostituire il supporto nei pozzetti con 200 microlitri di supporti privi di siero con destrano ad alto peso molecolare marcato con fluoroforo e posizionare le cellule nell'incubatore cellulare per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare il fluido e lavare delicatamente ma rapidamente le cellule cinque volte con PBS ghiacciato usando un flacone di lavaggio pre-raffreddato.

Scuotere saldamente la piastra a mano durante i lavaggi per aiutare a rimuovere gli aggregati destrani che si attaccano alle coperture. Quindi, fissare le cellule aggiungendo 350 microlitri di formaldeide al 3,7% e incubando per 20 minuti, quindi aspirare la soluzione di fissazione e lavare le cellule con PBS due volte. Macchiare i nuclei con 350 microlitri di DAPI in PBS.

Dopo 20 minuti, aspirare la soluzione DAPI e lavare le cellule con PBS tre volte. Aderisci agli isolatori in silicone affiancati su un vetrino per microscopio per ottenere una spaziatura uniforme e una localizzazione riproducibile dei coperchi necessari per l'automazione delle immagini. Quindi, per ogni coverslip, aggiungere una goccia di supporto di montaggio a fluorescenza indurente sul vetrino del microscopio all'interno dello spazio aperto dell'isolatore.

Raccogli una copertina usando una pinza e rimuovi il PBS in eccesso picchiettando delicatamente il lato delle coperture su una salvietta priva di lanugine. Quindi, posizionare il coverslip capovolto sulla goccia del supporto di montaggio e picchiettare delicatamente il coverslip utilizzando una pinza chiusa per rimuovere le bolle dal supporto di montaggio. Conservare le diapositive in un ambiente buio e lasciare asciugare il supporto di montaggio a temperatura ambiente, in genere impiegando da 16 a 24 ore.

Prima dell'imaging, rimuovere gli isolatori dal vetrino del microscopio. Dopo che le diapositive sono state bilanciate a temperatura ambiente, pulire le coperture utilizzando un applicatore con punta di cotone bagnato con detergente per vetri privo di ammoniaca. Successivamente, utilizzare un applicatore pulito con punta in cotone bagnato con etanolo al 70% per pulire il coperchio e lasciarlo asciutto.

Per il formato micropiastra a 96 pozzetti, dopo aver aspirato i pozzetti come dimostrato in precedenza, aggiungere 40 microlitri di supporti privi di siero con destrano ad alto peso molecolare marcato con fluoroforo ai pozzetti, quindi incubare le cellule nell'incubatore cellulare per 30 minuti. Dopo l'incubazione, scartare il fluido nella micropiastra facendo scorrere manualmente la piastra a testa in giù in un becher vuoto da cinque litri, quindi risciacquare due volte le celle e la micropiastra immergendo lentamente la piastra verticalmente con una leggera angolazione in un becher da due litri riempito con PBS ghiacciato e successivamente scartando il PBS nella micropiastra facendo scorrere la piastra a testa in giù nel becher da cinque litri. Dopo l'ultimo risciacquo PBS, fissare le celle aggiungendo 100 microlitri di formaldeide al 3,7% in PBS a ciascun pozzo utilizzando un serbatoio di reagente da 25 millilitri e una pipetta multicanale.

Dopo un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di fissazione e lavare le cellule con PBS utilizzando la tecnica di immersione e scorrimento. Dopo il secondo lavaggio PBS, colorare i nuclei con 100 microlitri di DAPI in PBS per pozzetto. Dopo 20 minuti, sciacquare le cellule tre volte con PBS ghiacciato come dimostrato in precedenza.

Rimuovere eventuali PBS residui picchiettando la micropiastra a testa in giù su una salvietta priva di lanugine. Quindi aggiungere 100 microlitri di PBS fresco a ciascun pozzo utilizzando un serbatoio di reagenti da 25 millilitri e una pipetta multicanale. Prima dell'imaging, lasciare che la piastra si equilibri a temperatura ambiente, quindi asciugare la piastra di coltura cellulare con una salvietta priva di lanugine.

In alternativa, conservare la piastra coperta dalla luce a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Per l'imaging automatizzato dei macropinosomi, creare un protocollo di automazione per acquisire le immagini con un obiettivo aereo 40X nel canale di lunghezza d'onda del fluoroforo destro e DAPI. Successivamente, ottimizzare le impostazioni di esposizione utilizzando un campione previsto per avere il più alto livello di macropinocitosi per evitare la sovraesposizione, che può comportare la saturazione del segnale e la perdita di dati di intensità.

Utilizzare le impostazioni di messa a fuoco che individuano in modo rapido e coerente il campione per produrre immagini di alta qualità. Acquisire più immagini in ogni pozzo o coverslip per tenere conto della variabilità del campione e ottenere una rappresentazione accurata del campione. Per determinare l'indice macropinocitico, sottrarre lo sfondo per il DAPI e l'immagine destrana corrispondente applicando la funzione appropriata, spesso chiamata funzione rolling ball.

Regolare le impostazioni in modo che il rumore di fondo sia ridotto al minimo o nessun effetto di sottrazione sul segnale DAPI e destro. Successivamente, utilizzando un campo con segnale ad alto destro, determinare le impostazioni del segnale di intensità, spesso chiamato funzione di soglia, per selezionare i nuclei, quindi determinare l'impostazione del segnale di intensità minima richiesta per selezionare solo i macropinosomi. Per l'immagine del destro, calcolare la fluorescenza totale all'interno della selezione del macropinosoma creata o utilizzare la selezione per determinare l'area totale positiva per il destro.

Per l'immagine DAPI, utilizzare la selezione per determinare il numero di nuclei nell'immagine per riflettere il numero di celle presenti. Quindi determinare l'indice macropinocitico dividendo la fluorescenza totale del destrano o l'area per il numero di cellule determinato dal DAPI. Nelle cellule AsPC-1 PDAK, l'aggiunta di EGF a 100 nanogrammi per millilitro per cinque minuti prima di aggiungere il destrano attiva la macropinocitosi.

Inoltre, l'attivazione autocrina dell'EGF della macropinocitosi può essere indotta dalla privazione di glutammina per 16-24 ore. Le cellule MIA PaCa-2 mostrano macropinocitosi costitutiva che viene inibita da un trattamento di 30 minuti con 75 EIPA micromolari o da un trattamento di due ore con 10 EHop-016 micromolari. In un esperimento di risposta alla dose, l'indice macropinocitico è gradualmente diminuito a concentrazioni di farmaco più elevate di EHop-016 e EIPA, confermando così l'esistenza di macropinocitosi costitutiva Rac1-dipendente.

È possibile adattare questa procedura per valutare la macropinocitosi di altri carichi contrassegnati con fluorescenza come l'albumina. Inoltre, si raccomanda di valutare se l'assorbimento macropinocitico dell'albumina contribuisce all'idoneità cellulare eseguendo saggi di vitalità cellulare. Questa tecnica è stata fondamentale per l'identificazione dell'apporto di nutrienti macropinocitici nel cancro e nelle cellule stromali e l'automazione ha notevolmente aumentato la nostra capacità di test delle condizioni.