Costruzione di membrane lipidiche modello che incorporano recettori accoppiati alla proteina G (GPCR)

Questo protocollo utilizza il gonfiore dell'agarosio come tecnica potente e generalizzabile per incorporare proteine di membrana integrali (PIM) in vescicole lipidiche unilamellari giganti (GUV), come descritto qui per la ricostituzione della proteina del recettore della serotonina 1A umana (_5-HT1AR), una delle classi di recettori accoppiati a proteine G farmacologicamente importanti.

Studiare le proteine di membrana integrali nel loro ambiente nativo è stata una sfida a causa della complessità della membrana plasmatica. Le vescicole lipidiche unilamellari giganti, o GUV, sono una delle piattaforme più importanti per studiare le proprietà della biomembrana e possono essere progettate per imitare varie condizioni fisiologiche. Questo protocollo descrive un metodo per fabbricare GUV incorporati in proteine basati sull'incorporazione spontanea, successiva al gonfiore dell'idrogel. I metodi tradizionali per fabbricare GUV non sono generalizzabili per l'incorporazione integrale di proteine di membrana. Questi metodi sono spesso a bassa resa, metodologicamente complessi e ad hoc, non applicabili ad ampie classi di proteine. D'altra parte, questo protocollo rappresenta un metodo flessibile, robusto e semplice per incorporare proteine di membrana integrali funzionali nei GUV.Abbiamo ottenuto questo obiettivo preparando un'impalcatura idrogel, contenente la proteina e depositando un sottile strato di lipidi sopra di esso. Nell'esempio qui presentato, abbiamo incorporato il recettore accoppiato alla proteina G, o GPCR, nei GUV.Dopo la reidratazione dell'intero sistema, i VUV germogliano dalla superficie dell'idrogel con la membrana contenente GPCR correttamente orientati.Consentire a tutti i reagenti di arrivare a temperatura ambiente. Durante questo periodo, pulire gli scivoli del coperchio mettendoli in metanolo e sonicando per 30 minuti a 40