Software di acquisizione dati intuitivo, ad alta produttività e completamente automatizzato per microscopia crioelettronica a particella singola

Il software di acquisizione dati automatizzato è estremamente necessario per raccogliere enormi quantità di dati criogenici per la caratterizzazione strutturale di macromoleculess biologici. Il pacchetto software di acquisizione dati automatizzato è stato utilizzato qui per caratterizzare la struttura di vari macromoleculess biologici, che sono direttamente associati alla biologia dei patogeni. Ad esempio, micobatterio, HIV e SASCO 2.

Per cominciare, avviare latitude-S Automated Data Acquisition Software facendo clic su DigitalMicrograph dal menu start. Quindi, selezionare Gestione tecnica, quindi l'icona Latitude-S per la raccolta automatica dei dati a particella singola. Per creare una sessione basata sulle impostazioni della sessione precedente, selezionare la casella di controllo In base alla sessione precedente nella tavolozza, quindi selezionare il pulsante Nuovo oppure per continuare una sessione esistente premere il pulsante Continua.

Per avviare una sessione completamente nuova, fai clic sulla nuova scheda nella tavolozza. Scegli la cartella contenente la sessione da continuare e seleziona la cartella in cui salvare i dati. Quindi, fai clic sull'icona delle impostazioni e nella casella di esplorazione dello stato gestito che appare, aggiungi stato, imposta la condizione TEM, la condizione della fotocamera e l'immagine o l'opzione stock.

Quindi, assegna un nome allo stato o apri il riepilogo della configurazione dello stato per aprire le impostazioni di salvataggio. Quindi, configura lo stato dell'Atlante facendo clic sulla tavolozza dello stato dell'Atlante e imposta i parametri per l'ingrandimento, le condizioni di illuminazione e il tempo di esposizione della fotocamera, quindi fai clic su Avanti per passare allo stato successivo. Quindi configurare lo stato della griglia facendo clic sulla tavolozza dello stato della griglia, impostare i parametri per l'ottica di imaging del microscopio, le condizioni di illuminazione e il tempo di esposizione della fotocamera e fare clic su Avanti.

Configurare lo stato del foro facendo clic sulla tavolozza dei fori e impostare l'ottica di imaging, le condizioni di illuminazione, il binning e i parametri del tempo di esposizione della fotocamera. Dopo aver fatto clic su Avanti, configurare lo stato di messa a fuoco successivo facendo clic sulla tavolozza di messa a fuoco e impostare le impostazioni del microscopio per l'ottica di imaging, le condizioni di illuminazione, il binning e il tempo di esposizione della fotocamera. Quindi concentrati sull'area di carbonio amorfo vicino al foro e fai clic su Avanti per passare allo stato successivo.

Configurare lo stato dei dati facendo clic sulla tavolozza dei dati e impostare i parametri per le impostazioni del microscopio, quindi fare clic su Avanti. Fare clic sulla tavolozza di configurazione della messa a fuoco specificando l'intervallo di valori di sfocatura e la dimensione del passo nella scheda specificata e premere il pulsante successivo per passare al passaggio successivo. Concentrati sulle funzionalità richieste sulla griglia e fai clic sul pulsante di acquisizione.

Quindi posiziona il segno della croce rossa sulla stessa caratteristica su ogni immagine di stati diversi. Inizia con gli stati Messa a fuoco, Dati e Foro, perché il campo visivo è maggiore degli stati Atlante e Griglia. Quindi, eseguire lo zoom sugli stati Atlante e Griglia per posizionare il segno della croce rossa sulla stessa feature.

Per calcolare le posizioni e l'offset tra ciascuno dei cinque diversi stati e riflettere le posizioni e gli offset nella finestra di output, fare clic sul pulsante Calcola. Fare clic sulla tavolozza di acquisizione e scegliere la dimensione dell'Atlante per coprire l'intera griglia o parte della griglia in base al requisito. Per catturare l'Atlante, naviga sull'Atlante e seleziona il quadrato della griglia in base allo spessore del ghiaccio.

Una volta selezionati i quadrati della griglia desiderati, fare clic sul pulsante di pianificazione e osservare le tessere nel quadrato della griglia riempirsi mentre ogni quadrato della griglia viene acquisito. Una volta fatto clic sul pulsante di pianificazione, selezionate un foro rappresentativo nel quadrato della griglia aggiungendo la posizione del foro. Una volta acquisita l'immagine del foro, definite i dati e le posizioni di messa a fuoco e salvate il layout come modello.

Fare clic su Ricerca automatica, immettere la dimensione del foro e fare clic sul pulsante Trova nel programma per trovare automaticamente i fori in base al diametro. Impostare l'intensità per rimuovere i fori dal quadrato della griglia e la contaminazione del ghiaccio. E dopo aver aggiunto gli strumenti di marcatura selezionati e gialli tramite la ricerca automatica, fare clic sul pulsante di pianificazione nelle attività di latitudine.

Secondo lo screening manuale iniziale delle micrografie corrette in movimento utilizzando il software cisTEM, la maggior parte dei dati è risultata essere all'interno della gamma di segnale desiderata. Inoltre, le immagini raccolte a intervalli di sfocatura sono state controllate manualmente da cisTEM. Le particelle spike sono state scelte manualmente per calcolare le medie di classe 2D per la visualizzazione strutturale, il che ha fortemente suggerito, ma la caratterizzazione strutturale ad alta risoluzione è stata possibile utilizzando il rispettivo set di dati.

La classificazione 3D ha indicato che Spike Protein ha 1RBD nella conferma aperta verso l'alto e tutti gli altri RBD nella conferma di chiusura verso il basso. Le conferme aperte 1RBD della proteina Spike sono state ricostruite utilizzando la simmetria C1. La mappa Spike Protein è rappresentata nelle viste laterali superiore e inferiore.

E la mappa EM è dotata di struttura atomica per una migliore visualizzazione delle catene laterali. Le conferme di chiusura RBD down sono state perfezionate con la simmetria C3 e il modello raffinato spike 3D e la mappa EM, dotati di struttura atomica come mostrato. E la conferma intermedia della proteina Spike identificata come sottodominio S2 indicava le catene laterali dei singoli residui di amminoacidi.

I risultati hanno suggerito che Latitude-S può raccogliere dati CRIO EM ad alta risoluzione di macromolecole biologiche. Questo software di raccolta automatica dei dati potrebbe essere utilizzato per qualsiasi altro sistema di microscopia elettronica per raccogliere automaticamente i dati.