Name: Modello animale di grandi dimensioni per valutare lefficacia della terapia genica nel cuore ischemico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Scopri un modello animale di grandi dimensioni per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico. Questo metodo a bassa invasività permette di studiare la sicurezza e l'efficacia prima delle sperimentazioni cliniche.

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Gli autori desiderano ringraziare Maria Hedman, Tiina Laitinen, Tomi Laitinen, Pekka Poutiainen, Annika Viren e Severi Sormunen per l'assistenza e il permesso di 15imaging O-PET presso l'ospedale universitario di Kuopio; e Heikki Karhunen, Minna Törrönen e Riikka Venäläinen del National Laboratory Animal Center per la loro assistenza nel lavoro sugli animali.
Questo studio è supportato da sovvenzioni di Finnish Academy, ERC e CardioReGenix EU Horizon 2020 grant.

Gli esperimenti presentati qui sono eseguiti utilizzando suini domestici femmina di circa 10 settimane e sono approvati dall'Animal Experiment Board in Finlandia. Gli animali pesano 30-40 kg all'inizio del protocollo, consentendo le stesse attrezzature procedurali e modalità di imaging possibili per gli esseri umani. L'ischemia cronica viene indotta 14 giorni prima del trasferimento genico e il tempo di follow-up dopo il trasferimento genico dipende dal vettore virale utilizzato. Il protocollo di studio è mostrato nella Figura 1. Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire iniezioni di terapia genica adenovirale o mediata da AAV. Il tempo di raccolta del campione deve essere adattato al picco di espressione del transgene, che dipende dal vettore virale utilizzato. Ad esempio, quando si eseguono trasferimenti di geni adenovirali, il tempo della raccolta del campione è impostato su 6 giorni dopo il trasferimento del genico.
1. Farmaci
<ol><li>Somministrare una dose giornaliera di 200 mg di amiodarone e 2,5 mg di bisoprololo per prevenire aritmie ventricolari fatali. Il farmaco inizia 1 settimana prima dell'operazione di ischemia e viene continuato quotidianamente fino al follow-up.</li>
	<li>Inoltre, somministrare dosi perorali di clopidogrel (300 mg) e acido acetilsalicilico (300 mg) agli animali 1 giorno prima dell'operazione di ischemia per prevenire la trombosi acuta nello stent dopo il posizionamento dello stent.</li>
	<li>Somministrare 100 mg di lidocaina e 2,5 ml di (246 mg/ml) di MgSO4 per via endovenosa agli animali all'inizio dell'operazione di ischemia per prevenire le aritmie ventricolari.</li>
	<li>Somministrare l'iniezione intramuscolare di cefuroxima (500 mg) all'inizio di ogni operazione per la profilassi dell'infezione.</li>
	<li>Somministrare 30 mg di enoxaparina per via endovenosa all'inizio delle operazioni di ischemia e per via sottocutanea dopo la procedura operativa per la prevenzione della trombosi.</li>
	<li>Per anestesia e analgesia, somministrare 1,5 ml di atropina, 6 ml di azaperone (40 mg/ml), propofol 20 mg/ml, in velocità di 15 mg/kg/h e fentanil 50 μg/ml in 10 μg/kg/h. I dosaggi dei farmaci erano gli stessi per ogni maiale. Fare riferimento alle linee guida locali per l'uso degli animali per la somministrazione della dose.</li>
	<li>Anestetizzare gli animali durante tutte le operazioni. Tutte le operazioni devono essere eseguite in un ambiente sterile utilizzando una tecnica sterile.</li>
</ol>2. Ecocardiografia transtoracica
<ol><li>Eseguire l'ecocardiografia transtoracica prima dell'operazione di ischemia, del trasferimento genico e dell'eutanasia per valutare qualsiasi liquido pericardico rilevabile e determinare il ceppo miocardico.</li>
	<li>Posizionare il trasduttore nel terzo o quarto spazio intercostale sotto l'ascella del maiale per accedere alle viste parasternali dell'asse corto a livello della valvola mitrale, del muscolo papillare e dei livelli apicali (Video 1). Il marcatore del trasduttore dovrebbe puntare allo sterno del maiale. Per salvare una clip, premere Acquisisci.</li>
</ol>3. Operazioni endovascolari sotto guida fluoroscopica
<ol><li>Eseguire l'imaging cine del ventricolo sinistro dopo angiogrammi coronarici prima dell'operazione di ischemia, trasferimento genico e raccolta di tessuti.</li>
	<li>Preparazione dell'operazione
	<ol><li>Prepararsi alle operazioni sedando i suini con un'iniezione intramuscolare di 1,5 ml di atropina e 6 ml di azaperone.</li>
		<li>Dopo la sedazione, indurre propofol generale e fentanil anestesia per le procedure angiografiche ai suini con dosi rispettivamente di 15 mg/kg/h e 10 μg/kg/h. NOTA: I maiali vengono anestetizzati per l'intera procedura.</li>
		<li>Sostenere la ventilazione mediante intubazione e ventilatore e monitorare i parametri fisiologici vitali, come ECG e parametri respiratori.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionamento della guaina dell'introduttore
	<ol><li>Posizionare una guaina introduttrice nell'arteria femorale destra per tutte le operazioni come pratica standard in cardiologia. Utilizzare gli ultrasuoni per tracciare l'arteria femorale e perforarla con un ago di ingresso (18 G). NOTA: Utilizzare una guaina introduttrice 8F per i trasferimenti genici intramiocardici e una guaina 6F per tutte le altre operazioni. Introdurre il filo guida della guaina attraverso l'ago per infilare l'arteria e tenere fermo il filo guida mentre si rimuove l'ago.</li>
		<li>Inserire la guaina introduttrice lungo il filo guida e, una volta posizionata, rimuovere il filo guida e somministrare 1,25 mg di dinitrato sublinguale al maiale per indurre la vasodilatazione coronarica.</li>
	</ol></li>
	<li>Angiografia coronarica
	<ol><li>Eseguire l'angiografia coronarica direttamente prima dell'operazione di ischemia, trasferimento genico e raccolta di tessuti. I macchinari necessari per gli angiogrammi sono mostrati nella Figura 2.</li>
		<li>Utilizzare un catetere 6F sotto guida fluoroscopica con un mezzo di contrasto allo iodio per visualizzare l'arteria coronaria destra e l'arteria coronaria ascendente sinistra (Video 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging cine del ventricolo sinistro a riposo e stress da dobutamina
	<ol><li>Somministrare un bolo di 21 mL di mezzo di contrasto di iodio nel ventricolo sinistro tramite un catetere a coda di maiale 5F utilizzando un autoiniettore. Innanzitutto, impostare la durata del bolo a 3 s e il volume totale per 21 ml. Quindi, premere Single e Sì.</li>
		<li>Calcolare la frazione di eiezione mediante il software di misura della postazione angiografica. Per eseguire il calcolo, selezionare Analisi ventricolare dell'immagine in questione. Scorrere l'immagine per selezionare un intervallo di tempo, uno in diastole e uno in sistole. Selezionare uno strumento per disegnare i contorni ventricolari di ogni intervallo di tempo. NOTA: il software ora calcola la frazione di eiezione e il volume della corsa con il metodo Simpson. La misurazione della frazione di eiezione viene eseguita durante il riposo e sotto stress indotto dalla dobutamina.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging dello stress
	<ol><li>Dosare dobutamina per via endovenosa in dosi crescenti da 10 μg/kg/min a 20 μg/kg/min per l'imaging da stress indotto da dobutamina fino al raggiungimento della frequenza cardiaca target di 160 bpm. Quindi, eseguire l'imaging cinematografico.</li>
	</ol></li>
	<li>Operazione di ischemia
	<ol><li>Posizionare uno stent a collo di bottiglia nell'arteria coronaria sinistra (LAD) 14 giorni prima del trasferimento del gene per indurre ischemia miocardica cronica. Dopo il posizionamento dello stent a collo di bottiglia, controllare se lo stent a collo di bottiglia è posizionato correttamente, limitando il flusso sanguigno coronarico. NOTA: Lo stent a collo di bottiglia è posto su un catetere di dilatazione ed è costituito da uno stent in metallo nudo coperto da un tubo di politetrafluoroetilene formato a forma di collo di bottiglia per ridurre il flusso sanguigno coronarico9.</li>
	</ol></li>
	<li>Definizione della dimensione dello stent
	<ol><li>Scegliere la dimensione dello stent, 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, in base alle dimensioni dell'arteria coronaria ascendente sinistra nell'angiogramma utilizzando il software di misurazione automatica nella workstation angiografica (Video 3)12.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionamento dello stent
	<ol><li>Posizionare una bobina sull'arteria coronaria sinistra e far scorrere lo stent a collo di bottiglia verso il LAD, posizionandolo distalmente alla prima diagonale.</li>
		<li>Gonfiare lo stent alla pressione nominale nell'arteria utilizzando un deflatore con un rapporto stent-lumen di 1,3, ancorando il collo di bottiglia in posizione. Dopo altri 15 s, sgonfiare lo stent e ritrarre l'apparecchiatura dall'arteria. NOTA: Confermare il corretto posizionamento dello stent a collo di bottiglia mediante angiogramma.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imaging PET
NOTA: Un giorno prima del trasferimento genico, eseguire il riposo e lo stress 15scansioni PET / CT radiowater marcate O (richiede ambiente ospedaliero e tecnici radiologici).
<ol><li>Imaging di riferimento
	<ol><li>Eseguire scansioni di tomografia computerizzata (TC) prima del riposo e dell'imaging da stress. Utilizzare le informazioni CT per la correzione dell'attenuazione.</li>
	</ol></li>
	<li>15Imaging radiowater marcato O
	<ol><li>Eseguire l'imaging del riposo e dello stress utilizzando un bolo di 800 MBq 15H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging dello stress
	<ol><li>Eseguire l'imaging da sforzo con un ulteriore bolo di 800 MBq 15 O-acqua dopo un decadimento radioattivo adeguato di 12min. NOTA: L'iperemia è indotta dall'adenosina (200 μg/kg/min per via endovenosa), come descritto in precedenza12.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Trasferimento genico
<ol><li>Mappatura elettroanatomica
	<ol><li>Procedere alla mappatura elettroanatomica dopo un angiogramma coronarico e misurazioni funzionali (ecocardiografia, imaging LV cine).</li>
		<li>Introdurre un catetere di mappatura al ventricolo sinistro tramite guaina femorale nella guida fluoroscopica. NOTA: Registrare circa 100-150 punti attorno al ventricolo sinistro con il catetere di mappatura per creare la mappa elettroanatomica.</li>
	</ol></li>
	<li>Completamento della mappa elettroanatomica
	<ol><li>Eliminare i punti anomali per garantire una mappa elettroanatomica più affidabile del ventricolo sinistro.</li>
		<li>A tale scopo, selezionare Piani di clip della mappa ed eliminare i punti che differiscono dai punti che formano la forma ventricolare. Quindi, selezionare Traiettorie per la vista mappa ed eliminare i punti che hanno percorso orizzontalmente durante la registrazione dei punti. NOTA: assicurarsi che i punti rimanenti coprano il ventricolo sinistro e registrare più punti, se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezioni di trasferimento genico
	<ol><li>Introdurre un catetere per iniezione intramiocardica al ventricolo sinistro attraverso la guaina femorale sotto guida fluoroscopica. Impostare la lunghezza dell'ago per iniezione su 3 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Criteri per le iniezioni intramiocardiche
	<ol><li>Guidare i trasferimenti genici mediante il sistema di mappatura elettroanatomica e indirizzare le iniezioni in aree vitali ma ipocinetiche del ventricolo sinistro. NOTA: per la vitalità, utilizzare una tensione unipolare superiore a 5 mV come criterio. Per l'ipocinesia, selezionare un accorciamento lineare locale (LLS) il più basso possibile, almeno al di sotto del 12% ma preferibilmente inferiore al 6%13.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniezioni intramiocardiche
	<ol><li>Durante 30 s, iniettare il materiale vettore nel punto di selezione (fase 5.4) e tenere l'ago per iniezione all'interno del miocardio per altri 5 secondi prima di ritrarsi per evitare il riflusso al ventricolo sinistro.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Eutanasia e raccolta di campioni
NOTA: Dopo le misurazioni dell'angiogramma coronarico e della frazione di eiezione descritte rispettivamente nei punti 3.4.1 e 3.5.2, somministrare 50 ml di cloruro di potassio saturo per via endovenosa al maiale anestetizzato.
<ol><li>Fissazione per perfusione del cuore
	<ol><li>Raccogli il cuore dalla cavità toracica. Risciacquare con acqua. Posizionare un ago da 18 G sopra la valvola aortica e collegare l'ago a una pompa di perfusione. Perfondere il cuore con 750 ml di paraformaldeide (PFA) all'1%.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta di campioni
	<ol><li>Tagliare il cuore a fette spesse 1 cm usando un coltello da cucina affilato. Raccogliere i campioni dall'area di trasferimento genico in PFA al 4% e azoto liquido. NOTA: Per raccogliere i controlli negativi, raccogliere un campione di controllo dalla parete posteriore del ventricolo sinistro.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta di tessuti di sicurezza
	<ol><li>Preleva campioni da tessuti remoti, come polmone, fegato, reni, milza e ovaie. Prelevare campioni in PFA al 4% e azoto liquido.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Conservazione dei campioni
<ol><li>Conservare i campioni per la colorazione in PFA al 4% per 48 ore a 4 °C. NOTA: Sostituire il PFA ogni giorno con un liquido fresco.<ol><li>Dopo 48 ore, sostituire il PFA con il 15% di saccarosio in acqua deionizzata. Conservare per almeno 24 ore prima di incorporare i campioni in blocchi di paraffina. I campioni congelati a scatto vengono conservati a -70 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

I timepoint di questo protocollo possono essere modificati in base al vettore virale utilizzato. Inoltre, le analisi immunoistologiche possono essere selezionate in base al gene terapeutico. È anche possibile aggiungere più timepoint ed endpoint al protocollo, se necessario.
Questo protocollo comprende fasi, che sono essenziali per avere successo e impossibili da correggere in seguito. In primo luogo, se non si riesce a indurre un'ischemia appropriata, l'animale deve essere escluso da ulterior...

La malattia coronarica è responsabile della vasta percentuale di mortalità e carico di malattia in tutto il mondo1. Le attuali strategie di trattamento sono interventi percutanei, trattamento farmacologico e chirurgia di bypass2. Tuttavia, nonostante la progressione di queste attuali terapie, molti pazienti soffrono della cosiddetta angina refrattaria, sottolineando il bisogno insoddisfatto di nuovi approcci terapeutici3. L'angiogenesi terapeutica mediata dalla terapia genica potrebbe colpire questo gruppo di pazienti.
La terapia genica miocardica viene spesso somministrata utilizzando diversi vettori virali, più comunementeadenovirus 4 carente di replicazione. Come geni terapeutici, vengono utilizzati vari fattori di crescita angiogenici. I fattori di crescita angiogenici più studiati sono i fattori di crescita endoteliali vascolari (VEGF) che mediano la loro segnalazione angiogenica attraverso i recettori del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR) e i loro co-recettori5. Diversi studi clinici hanno dimostrato il beneficio e la sicurezza della terapia genica cardiaca e hanno reso questo nuovo metodo di trattamento un'opzione realistica per il trattamento delle cardiopatie ischemiche 6,7. Tuttavia, questo concetto ha ancora bisogno di migliorare i geni terapeutici e i vettori virali messi alla prova in modelli animali di grandi dimensioni prima di entrare nelle cliniche. Il maiale è stato spesso usato come animale da laboratorio poiché il suo cuore è molto simile al cuore umano. La dimensione del sistema cardiovascolare di un maiale consente l'utilizzo di invenzioni simili a quelle utilizzate negli esseri umani. Tutte le modalità di imaging disponibili per l'uomo possono essere utilizzate nei suini8.
Esistono diversi modelli animali di grandi dimensioni per l'ischemia cronica. Il più comunemente usato è il costrittore ameroide modello 9,10,11. Lo svantaggio di questo metodo è l'invasività poiché la toracotomia è necessaria per accedere alla vascolarizzazione coronarica. In precedenza nel nostro gruppo, è stato sviluppato un modello di stent mini-invasivo a collo di bottiglia per l'ischemia miocardica cronica12. Questo metodo è anche usato in questo manoscritto per indurre ischemia miocardica.
L'usabilità dell'imaging a ultrasuoni si è evoluta sostanzialmente nonostante l'età della modalità di imaging. Ad esempio, il ceppo miocardico è ancora principalmente in uso nella ricerca a causa della sua novità. Lo sforzo miocardico riflette i cambiamenti nella funzione contrattile del cuore meglio della tradizionale misurazione della frazione di eiezione M-mode13. Pertanto, qui nel grande modello animale, viene utilizzata la misurazione dello sforzo miocardico. Per valutare la funzione del cuore, la gittata cardiaca viene misurata anche mediante imaging cinematografico del ventricolo sinistro durante l'angiografia. La gittata cardiaca viene misurata sia a riposo che sotto stress indotto da dobutamina per valutare la funzione miocardica sotto stress.
Oltre alle misurazioni della funzione cardiaca, le informazioni sulla perfusione miocardica sono essenziali negli studi di terapia genica finalizzati all'angiogenesi terapeutica. In questo modello animale, gli animali vengono ripresi con 15 tomografie ad emissione di positroni a radioacqua marcate O (15H2O-PET) poiché questo è lo standard d'oro per misurare la perfusione miocardica. 15H2O-PET è stato precedentemente validato per misurare la perfusione di cuore suino ischemico14.
Pertanto, i metodi e le modalità sopra menzionati costituiscono un'ottima prospettiva per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico.

<table><tbody><tr><td>1% PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Preparato a partire da polvere di paraformaldeide</td></tr><tr><td>15 % saccarosio</td><td>VWR</td><td>VWRC27480.294</td><td>Preparato a partire da saccarosio solido</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>VWR</td><td>VWRC28794.295</td><td>Preparato a partire da polvere di paraformaldeide</td></tr><tr><td>5 catetere a spirale F</td><td>Cordis</td><td>534-550S Catetere</td><td></td></tr><tr><td>6 F AR2</td><td>Cordis</td><td>670-112-00</td><td></td></tr><tr><td>Guaina introduttrice 6 F</td><td>Cordis</td><td>504-606X</td><td></td></tr><tr><td>Guaina introduttrice 8 F</td><td>Cordis</td><td>504-608X</td><td></td></tr><tr>Acido <td></td><td></td><td>acetilsalicilico</td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Amiodarone</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Stazione angiografica</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Set da angiolaboratorio</td><td>M&ouml; </td><td></td><td>Progettato per le esigenze del nostro angiolaboratorio, contiene teli, coppette e tamponi sterili</td></tr><tr><td>Bisoprololo</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Cefuroxima</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Clopidogrel</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Stent Coroflex Blue</td><td>B.Braun Medical</td><td>5029012</td><td>Il numero di catalogo dipende dalle dimensioni dello stent</td></tr><tr><td>Crile </td><td></td><td></td><td></td>pinza</tr><tr><td>Ciclotrone</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dobutamina</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Sistema di mappatura elettroanatomica</td><td>Sistemi di somministrazione di farmaci biologici, Johnson & Azienda</td><td></td><td></td>Johnson</tr><tr><td>Enoxaparin</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Catetere per iniezione intramiocardica</td><td>Johnson & </td><td></td><td></td>Johnson</tr><tr><td>Iodio mezzo di contrasto</td><td>Iomeron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coltello da</td><td></td><td></td> cucina <td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Lidocaina</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td> liquido <td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Ago 18 G</td><td>Cordis</td><td>12-004943</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di</td><td></td><td></td><td></td>perfusione</tr><tr><td>Scanner PET-CT</td><td>Siemens Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td></td><td></td><td></td>di politetrafluoroetilene</tr><tr><td>Propofol</td><td></td><td></td><td>Produttore variabile</td></tr><tr><td>Bisturi n. 11</td><td>VWR</td><td>SWAN0503</td><td></td></tr><tr><td>Dinitrato sublinguale</td><td>Takeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecografo</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modello animale di grandi dimensioni per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico

Large Animal Model for Evaluating the Efficacy of the Gene Therapy in Ischemic Heart

La malattia coronarica è una delle cause significative di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Nonostante la progressione delle attuali terapie, una percentuale considerevole di pazienti con malattia coronarica rimane sintomatica. L'angiogenesi terapeutica mediata dalla terapia genica offre un nuovo metodo terapeutico per migliorare la perfusione miocardica e alleviare i sintomi. La terapia genica con diversi fattori angiogenici è stata studiata in pochi studi clinici. A causa della novità del metodo, il progresso della terapia genica miocardica è un percorso continuo dal banco al letto del paziente. Pertanto, sono necessari modelli animali di grandi dimensioni per valutare la sicurezza e l'efficacia. Più il grande modello animale identifica la malattia originale e gli endpoint utilizzati nelle cliniche, più i risultati prevedibili sono dagli studi clinici. Qui, presentiamo un grande modello animale per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore suino ischemico. Utilizziamo metodi di imaging clinicamente rilevanti come l'ecografia e l'O-PET 15H2. Per indirizzare i trasferimenti genici nell'area desiderata, viene utilizzata la mappatura elettroanatomica. Lo scopo di questo metodo è: (1) imitare la malattia coronarica cronica, (2) indurre l'angiogenesi terapeutica nelle aree ipossiche del cuore e (3) valutare la sicurezza e l'efficacia della terapia genica utilizzando endpoint rilevanti.

Il successo dell'operazione di ischemia può essere confermato con questo protocollo mediante angiogramma coronarico e determinando l'area ipocinetica mediante ecografia transtoracica (Figura 1) prima di procedere alla consegna del gene. Lo stato dell'occlusione coronarica può essere valutato mediante angiogramma coronarico, e la mappatura elettroanatomica assicura le aree ischemiche e di ibernazione.
L'efficacia della terapia genica può essere analizzata misurando...

La terapia genica miocardica per la cardiopatia ischemica è molto promettente per le terapie future. Qui, introduciamo un grande modello animale per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico.

Modello animale di grandi dimensioni per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico

Coronary artery disease is one of the significant causes of mortality and morbidity worldwide. Despite the progression of current therapeutics, a ...

I metodi e le modalità di imaging utilizzati in questo protocollo costituiscono un'immagine eccellente della sicurezza e dell'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico prima di procedere agli studi clinici. I principali vantaggi di questa tecnica sono la bassa invasività del modello ischemico, ma anche il preciso targeting della terapia genica verso aree ipocinetiche ma ancora vitali del cuore. Inizia eseguendo l'ecocardiografia transtoracica prima dell'operazione di ischemia, il trasferimento genico e l'eutanasia per valutare qualsiasi liquido pericardico rilevabile e determinare il ceppo miocardico.Posizionare il trasduttore nel terzo o quarto spazio intercostale sotto l'ascella del maiale con un marcatore che punta allo sterno del maiale per accedere alle viste dell'asse corto parasternale a livello della valvola mitrale, del muscolo papillare e dei livelli apicali. Quindi premere acquisisci per salvare una clip. Per eseguire l'angiografia coronarica direttamente prima dell'operazione di ischemia utilizzare un catetere 6-F sotto guida fluoroscopica con un mezzo di contrasto di iodio per visualizzare l'arteria coronaria destra, l'arteria coronaria ascendente sinistra e l'arteria discendente anteriore sinistra.Per l'imaging cinematografico nell'autoiniettore, impostare la durata del bolo a tre secondi e il volume totale per 21 millilitri, quindi premere singolo e sì per somministrare il mezzo di contrasto allo iodio nel ventricolo sinistro tramite un catetere a coda di maiale 5-F. Eseguire l'imaging cinematografico dell'animale a riposo e quindi somministrare dobutamina per via endovenosa e dosi crescenti per l'induzione dello stress. Una volta raggiunta la frequenza cardiaca target di 160 battiti al minuto, esegue l'imaging cinematografico e rimuove il catetere pigtail.Per calcolare la frazione di eiezione aprire il software di misura, selezionare l'analisi ventricolare dell'immagine in questione. Scorrere l'immagine per selezionare un intervallo di tempo, uno in diastole e uno in sistole, quindi selezionare uno strumento per disegnare i contorni ventricolari di ciascun intervallo di tempo. Per indurre l'ischemia miocardica cronica, 14 giorni prima del trasferimento genico, posizionare una bobina sull'arteria coronaria sinistra e far scorrere lo stent a collo di bottiglia sull'arteria coronaria sinistra e posizionare lo stent distalmente alla prima diagonale.Gonfiare lo stent alla pressione nominale nell'arteria, utilizzando un indeflatore con un rapporto stent/lume di 1,3 per ancorare il collo di bottiglia in posizione. Dopo altri 15 secondi, sgonfiare lo stent, ritrarre l'apparecchiatura dall'arteria e garantire il corretto posizionamento di uno stent a collo di bottiglia mediante angiografia. Dopo l'angiografia e le misurazioni funzionali sotto guida fluoroscopica, introdurre un catetere di mappatura al ventricolo sinistro attraverso la guaina femorale per la mappatura elettroanatomica e raccogliere almeno 100 punti dal ventricolo sinistro e fare clic su accetta per approvare un punto.Nella mappa finale, per la vitalità, utilizzare una tensione unipolare su cinque millivolt come criterio. E per l'ipocinesia, selezionare un accorciamento lineare locale il più basso possibile, almeno fino al 12% ma preferibilmente inferiore al 6%Dopo l'eutanasia dell'animale, raccogliere il cuore dalla cavità toracica. Una volta che il cuore raccolto è stato risciacquato, posizionare un ago di gauge 18 sopra la valvola aortica e collegare l'ago a una pompa di perfusione.Perfondere il cuore con 750 millilitri di paraformaldeide all'1%. Utilizzare un coltello affilato per tagliare il cuore in fette spesse un centimetro e raccogliere i campioni dall'area di trasferimento genico in paraformaldeide al 4% e azoto liquido. Conservare i campioni per la colorazione in paraformaldeide al 4% per 48 ore a quattro gradi Celsius.L'efficacia della terapia genica è stata analizzata misurando il ceppo circonferenziale, la frazione di eiezione e la perfusione miocardica mediante scansione PET 15O-acqua. I campioni di tessuto possono essere raccolti direttamente dall'area di trasferimento genico, confrontando il cuore con la mappa elettroanatomica. L'espressione del transgene e l'angiogenesi terapeutica sono state valutate attraverso l'analisi istologica immunitaria analizzando il numero di cellule positive dopo colorazione della beta-galattosidasi e analizzando l'area capillare miocardica, dopo colorazione della molecola di adesione piastrinica/endoteliale-1.È importante confermare il posizionamento dello stent a collo di bottiglia tramite angiogramma e raccolta di campioni dall'area di trasferimento genico, che potrebbe essere confermata confrontando il cuore con la mappa elettroanatomica. Nel complesso, è fondamentale effettuare tutte le misurazioni nel modo più riproducibile.

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Un metodo di trasferimento genico per il trattamento dell'insufficienza cardiaca ischemica è descritta utilizzando un modello suino di infarto miocardico. Il nostro metodo semplice e riproducibile ci permette di valutare rapidamente l'efficacia dei trasferimenti di geni diversi, con un modo molto semplice e riproducibile.

Trasferimento Genico per insufficienza cardiaca ischemica in un modello preclinico

Questo protocollo descrive il modello suino infarto del miocardio (MI) con un 90 min-torace chiuso palloncino occlusione coronarica discendente anteriore sinistra (LAD), seguita da riperfusione. Inoltre, il protocollo per diversi parametri di risultato, come la funzione cardiaca, emodinamica, resistenza microvascolare e dimensioni dell'infarto, sono anche presentato.

Infarto miocardico e funzionale Outcome Assessment in Pigs

Lo scopo del presente protocollo è quello di dimostrare il posizionamento di un dispositivo costrittivo in ritardo (un constrictor ameroid) intorno a un'arteria coronaria in un modello di suina. Questo dispositivo crea una zona ischemica del cuore che è utile per lo studio di nuove tecniche di imaging diagnostiche e nuovi metodi di trattamento.

Un modello di Ischemia cardiaca cronica nei suini utilizzando un Constrictor Ameroid

Qui presentiamo un protocollo per l'induzione di cryoinjury ventricolare sinistra seguita dall'impianto di una patch di muscolo cardiaco, derivata da cardiomiociti iPS-cellula umana in un modello della cavia.

Impianto di hiPSC-derivato del muscolo cardiaco patch dopo lesione del miocardio in un modello della cavia

Qui, descriviamo un modello preclinico di grandi animali (porcine) di trapianto ortotopico del cuore che è stato saldamente stabilito e utilizzato per studiare nuove strategie cardioprotettive.

Un modello pre-clinico di trapianto di cuore ortotopico

Abbiamo cercato di stabilire un modello suine di insufficienza cardiaca indotta dal blocco dell'arteria circumflex sinistra e dal rapido ritmo per testare l'effetto e la sicurezza della somministrazione intramiocardiale delle cellule staminali per terapie basate sulle cellule.

Istituzione di un modello suina di infarto post-miocardico per il trattamento delle cellule staminali

Questo protocollo mira a trapiantare un cerotto biostampato 3D sull'epicardio di topi infarti che modellano l'insufficienza cardiaca. Include dettagli riguardanti l'anestesia, l'apertura chirurgica del torace, la legatura permanente dell'arteria coronaria anteriore sinistra (LAD) e l'applicazione di un cerotto biostampato sull'area infartata del cuore.

Trapianto di una patch biostampa 3D in un modello Murine di infarto miocardico

Il presente protocollo descrive i metodi per l'espressione transgenica nei cuori di ratto e topo mediante iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida ecocardiografica. Qui vengono spiegati anche i metodi per la valutazione della suscettibilità dei cuori alle aritmie ventricolari mediante la stimolazione elettrica programmata di cuori isolati perfusi da Langendorff.

Espressione del transgene virale nei cuori dei roditori e valutazione del rischio di aritmia cardiaca

Il presente protocollo descrive tre metodi di somministrazione di agenti terapeutici cardioattivi in un modello suino. Le femmine di suino autoctono hanno ricevuto un trattamento attraverso: (1) toracotomia e iniezione transepicardica, (2) iniezione transendocardica basata su catetere o (3) infusione endovenosa tramite minipompa osmotica della vena giugulare.

Somministrazione di terapie cardioattive in un modello di infarto miocardico suino

Il presente studio dimostra un modello animale altamente riproducibile di ischemia miocardica regionale acuta e danno da riperfusione nei conigli utilizzando una mini-toracotomia sinistra per i casi di sopravvivenza o una sternotomia della linea mediana per i casi di non sopravvivenza.

Modello di danno da ischemia e riperfusione nei conigli

Scopri un modello animale di grandi dimensioni per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico. Questo metodo a bassa invasività permette di studiare la sicurezza e l'efficacia prima delle sperimentazioni cliniche.

Modello animale di grandi dimensioni per valutare l'efficacia della terapia genica nel cuore ischemico

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