Test di assorbimento delle vescicole extracellulari tramite analisi di imaging al microscopio confocale

Questo protocollo fornisce una solida metodologia per l'analisi dei veicoli elettrici a livello cellulare e un approccio pratico per l'assorbimento efficiente dei veicoli elettrici e l'analisi del tracciamento dei veicoli elettrici. Questo metodo di etichettatura EV elimina la co-precipitazione di veicoli elettrici e coloranti, migliorando così i segnali EV. L'assorbimento dei veicoli elettrici viene misurato mediante analisi volumetrica per distinguere i veicoli elettrici internalizzati dai veicoli elettrici superficiali.

I veicoli elettrici sono carichi attivi, quindi il loro assorbimento consente il trasferimento di molecole biochimiche. Per la ricerca sulla somministrazione di farmaci basata su EV e sulla terapia del cancro, questa tecnica può essere uno strumento di valutazione. L'assorbimento di EV svolge un ruolo nella comunicazione intercellulare ed è studiato in vari campi di ricerca, come la biologia del cancro, le neuroscienze e la somministrazione di farmaci.

Questo protocollo facilita potenzialmente un efficiente test di assorbimento dei veicoli elettrici. Per l'isolamento di vescicole extracellulari, o EV, iniettare un millilitro di terreno di coltura cellulare pre-elaborato nella camera del campione del dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione. Per far funzionare il dispositivo, ruotare il dispositivo nella filatrice da banco a 3000 RPM per 10 minuti.

Dopo la filatura, rimuovere il fluido dalla camera di scarico mediante pipettaggio o aspirazione, quindi ripetere questa procedura due volte per elaborare altri due millilitri del terreno di coltura cellulare. Successivamente, per lavare i veicoli elettrici isolati, iniettare un millilitro di PBS nella camera del campione e far girare il dispositivo nella filatrice da banco. Per l'etichettatura immunofluorescente dei veicoli elettrici, iniettare un microgrammo per millilitro dell'anticorpo ev-specifico nel foro di eluizione del dispositivo contenente 100 microlitri di veicoli elettrici isolati.

Quindi incubare per un'ora al buio su uno shaker a piastre per garantire la distribuzione uniforme dell'anticorpo attraverso il campione. Quindi, attaccare un nastro adesivo al foro di eluizione. Iniettare un millilitro di PBS nella camera del campione per lavare gli anticorpi residui, quindi far girare il dispositivo fino a quando la camera del campione è vuota.

Ripetere il lavaggio iniettando un altro millilitro di PBS nella camera del campione e ruotando il dispositivo come dimostrato in precedenza. Dopo aver rimosso il fluido residuo dalla camera, pipettare i veicoli elettrici marcati fluorescenti dalla camera a membrana in un tubo ambrato o micro tubo. Proteggere il tubo dalla luce fino all'uso.

Semina quattro volte 10 alla quarta cella PC3 in un piatto da 35 millilitri con un mezzo millilitro. Consentire alle cellule di aderire durante la notte in condizioni ottimali di coltura cellulare. Il giorno seguente, lavare le cellule aderenti due volte con mezzi impoveriti di esosomi.

Dopo aver diluito i veicoli elettrici marcati fluorescentemente alla concentrazione appropriata utilizzando mezzi impoveriti di esosomi, aggiungere i veicoli elettrici diluiti alle cellule bersaglio aderenti e incubare per il tempo sperimentale desiderato. Dopo aver rimosso gli EV non internalizzati lavando le cellule tre volte con mezzi privi di esosomi, etichettare il citoplasma delle cellule aderenti con un microgrammo per millilitro di CMTMR e incubare in condizioni ottimali di coltura cellulare. Per l'imaging di cellule vive, posizionare le cellule preparate nell'incubatrice sul palco.

Dopo aver impostato i parametri di imaging in base ai campioni di controllo, determinare la profondità delle celle target e l'intervallo di dimensioni di impilamento nella direzione Z per acquisire immagini confocali 3D, quindi impostare l'acquisizione dell'immagine su più immagini impilate Z sia del colorante specifico della cellula che del colorante specifico EV contemporaneamente. Per l'elaborazione delle immagini, utilizzare un software di elaborazione automatica delle immagini. Per creare superfici virtuali delle celle, fare clic su Aggiungi nuove superfici.

Per configurare le superfici delle celle virtuali, fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare Qualità come tipo di filtro. Soglie il valore appropriato per il limite basso mediante ispezione visiva, impostare il valore massimo per il limite superiore e fare clic sul pulsante Fine Avanti, per costruire i punti virtuali dei veicoli elettrici, fare clic sul pulsante Aggiungi nuovi spot. In Impostazioni algoritmo, seleziona Diverse dimensioni spot e Calcolo della distanza più breve, quindi fai clic su Avanti e seleziona Canale 1 Alexa Fluor 488 come canale sorgente.

Immettete il valore appropriato per il diametro XY stimato in Rilevamento punti e fate clic su Avanti. Per configurare i punti EV virtuali, fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare Qualità come tipo di filtro. Impostate la soglia inferiore mediante un'ispezione visiva e fate clic su Avanti Per il tipo di regioni spot, selezionate Intensità assoluta (Absolute Intensity), quindi fate clic su Avanti (Next).

Per sogliere la regione dei punti EV, immettere il valore appropriato per Region Threshold mediante ispezione visiva. Selezionate Diametro da sotto Volume regione (Region Volume) e fate clic su Fine (Finish). Per dividere i punti raggruppati all'interno della superficie costruita, fai clic su Costruisci punti e vai in Filtri.

Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi e selezionare Distanza più breve dalle superfici, Superficie superfici 1 come tipo di filtro. Dopo aver impostato la soglia più bassa per il limite basso e il valore appropriato per il limite superiore, fate clic sul pulsante Duplica sezione per visualizzare i nuovi spot. Per il conteggio automatico dei veicoli elettrici all'interno delle celle, fai clic sulla selezione Spot costruiti 1, vai a Statistiche ed esporta il valore dal Numero totale di spot.

Per ottenere il numero di celle, fare clic su Superfici costruite 1, quindi passare a Statistiche ed esportare il valore di Numero totale di superfici da Complessivo. Infine, vai alla scheda Dettagli in Statistiche per esportare il volume. I veicoli elettrici isolati dai terreni di coltura cellulare PC3 utilizzando un dispositivo microfluidico basato sulla nanofiltrazione sono stati etichettati con un anticorpo specifico EV coniugato fluoro-4 e visualizzati utilizzando la microscopia confocale 3D.

I veicoli elettrici internalizzati sono stati visualizzati come puncta e una singola EV.Post-elaborazione di queste immagini consente la visualizzazione e la quantificazione dell'internalizzazione EV nelle celle. I risultati del test di assorbimento dei veicoli elettrici indicano che il livello di assorbimento dei veicoli elettrici dipende dalla durata del periodo di incubazione. Il numero di veicoli elettrici internalizzati può essere normalizzato al volume della cella ricevente per determinare il tasso effettivo di assorbimento dei veicoli elettrici per la cella specificata.

Questa procedura consente l'esclusione sistematica dei veicoli elettrici non internalizzati per misurare con precisione il numero di veicoli elettrici internalizzati. La distribuzione dimensionale dei punti EV internalizzati è mostrata qui. Quindi i passaggi chiave sono l'utilizzo del dispositivo microfluidico per l'etichettatura dei veicoli elettrici, la minimizzazione della fluorescenza di fondo durante la visualizzazione di veicoli elettrici fluorescenti e quindi l'analisi post-imaging per determinare i veicoli elettrici internalizzati rispetto a quelli superficiali.

Quindi il tracciamento intracellulare ev può essere eseguito in tempo reale su un piano 3D e, inoltre, è possibile ottenere l'analisi del traffico EV su risoluzioni spaziali / temporali e la co-localizzazione di veicoli elettrici con organelli subcellulari. Quindi crediamo che questa tecnica fornisca un modo più semplice ed efficiente per studiare i veicoli elettrici all'interno delle matrici intra ed extracellulari per i ricercatori nel campo della comunicazione cellulare per i veicoli elettrici.