Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni

Questo protocollo utilizza la microscopia a super-risoluzione, in particolare la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta, nota anche come dSTORM, per aggirare il limite di diffrazione e visualizzare i veicoli elettrici con precisione nanometrica in tre dimensioni. Un notevole vantaggio di dSTORM è la sua capacità di visualizzare direttamente le particelle al di sotto del livello di diffrazione della luce senza danneggiare i passaggi che alterano la natura biochimica dell'EV. Molti virus evolutivamente distinti impiegano la segnalazione EV, quindi dSTORM può essere impiegato per caratterizzare i veicoli elettrici per i biomarcatori e la progressione della malattia, nonché per visualizzare singole particelle virali, come SARS-CoV2. Inizia posizionando vescicole extracellulari purificate per affinità, o EV, su piastre a fondo di vetro, microslide, otto pozzetti in un volume totale di 200 microlitri e consenti loro di aderire alla superficie durante la notte a quattro gradi Celsius.

Senza rimuovere la soluzione esistente dalla piastra a otto pozzetti, fissare i veicoli elettrici sulle piastre aggiungendo 200 microlitri di paraformaldeide al 4% in 1X PBS alla soluzione contenente EV in ciascun pozzetto e consentire alle piastre di incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione la paraformaldeide e la soluzione in eccesso con una micropipetta per non disturbare i veicoli elettrici. Lavare l'EV con 1X PBS per rimuovere l'eccesso di paraformaldeide.

Eseguire la procedura di lavaggio tre volte. Rimuovere l'eccesso di 1X PBS. Preparare 250 microlitri di soluzione tampone dSTORM Bcubed per campione creando una soluzione di diossigenasi protocatechuica a cinque millimolari diluita nel tampone di imaging secondo il protocollo del produttore.

Aggiungere 250 microlitri del tampone preparato a ciascun pozzo secondo il protocollo del produttore e incubare le piastre per 20 minuti a temperatura ambiente prima dell'imaging per eliminare le molecole ossidanti. I veicoli elettrici possono essere visualizzati immediatamente o conservati a quattro gradi Celsius per una settimana. Per preparare le perline necessarie per la calibrazione del microscopio a super-risoluzione, diluire microsfere da 100 nanometri ad una concentrazione dello 0,5% in acqua di grado di biologia molecolare e pipettare 200 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a otto pozzetti con fondo di vetro, microslide, otto pozzetti.

Lasciare che le perline si depositino nei pozzetti per un'ora a temperatura ambiente. Senza rimuovere la soluzione esistente, aggiungere 200 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS a ciascun pozzetto alla soluzione di perline di calibrazione e lasciare incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura la paraformaldeide con una micropipetta per non disturbare le perline e lavare le perline tre volte con 1X PBS.

Preparare il buffer come descritto nel manoscritto. Rimuovere 1X PBS e aggiungere 250 microlitri del buffer preparato a ciascun pozzetto. Lasciare riposare il buffer per 20 minuti prima della visualizzazione.

Utilizzare il pulsante Connetti il microscopio per connettersi al microscopio 3D prima di posizionare qualsiasi cosa sul palco. Aggiungi olio 100X all'obiettivo e posiziona il centro del pozzo sopra l'obiettivo. Nell'impostazione Acquisisci, attiva i laser di eccitazione a 473 e 640 nanometri e fai clic su Visualizza.

Senza attivare l'obiettivo 3D, visualizzare le perline sotto l'impostazione di saturazione dei fotoni facendo clic su Conteggi fotoni nelle Opzioni di visualizzazione delle immagini. Impostare le potenze laser iniziali su 8,4 milliwatt per il laser a 473 nanometri e 11,6 milliwatt per il laser a 640 nanometri. Diminuire la messa a fuoco del laser a circa meno 300 nanometri o il piano focale delle perle di calibrazione per produrre una chiara risoluzione delle singole perle.

Una volta che il piano Z è focalizzato, regolare ulteriormente i livelli di potenza del laser per tenere conto della variazione in ciascun campo visivo. Sotto le funzioni Strumento, completare la calibrazione della mappatura 3D e la calibrazione della mappatura dei canali per ottenere gli errori sugli assi X, Y e Z. impostare il numero massimo di campi visivi su 20, il numero target di punti su 4.000, la distanza massima tra i canali a 5,0 pixel e il raggio di esclusione tra i canali a 10,0 pixel durante la calibrazione della mappatura dei canali.

Assicurarsi che la calibrazione produca una copertura puntuale superiore al 90% e una qualità di mappatura buona. Salvare i dati di calibrazione forniti per future acquisizioni di immagini. Aggiungere olio 100X sull'obiettivo e posizionare i veicoli elettrici preparati sul microscopio.

Senza attivare la lente 3D, accendere il laser di eccitazione a 640 nanometri e inizialmente portarlo tra 1,2 e 12,5 milliwatt, a seconda dell'intensità del segnale nel campo visivo per eccitare la membrana rossa, intercalare, i veicoli elettrici macchiati di colorante. In Opzioni di visualizzazione immagine, cambia il metodo di visualizzazione dalla saturazione dei fotoni ai percentili per visualizzare meglio i veicoli elettrici. Regola la potenza del laser per ridurre al minimo il rumore massimizzando il segnale e mantenendo tutti gli altri parametri.

Regolate la messa a fuoco del piano Z facendo clic sull'icona su o giù sull'asse Z. Impostare il tempo di esposizione su 20 millisecondi, l'acquisizione del fotogramma su 10.000 fotogrammi e la potenza laser iniziale su 1,2 e 12,5 milliwatt, a seconda dell'intensità del segnale e del campo visivo. Attiva l'obiettivo 3D utilizzando l'icona e avvia l'acquisizione facendo clic sul pulsante Acquisisci.

Durante tutto il processo di acquisizione delle immagini, aumentare la potenza del laser di tre incrementi di 10 ogni 1000 fotogrammi, o abbastanza per mantenere un elevato rapporto segnale-rumore. Non regolare il piano Z durante l'acquisizione. Dopo l'acquisizione dell'immagine, passare alla finestra di visualizzazione Analizza.

Eseguire la correzione della deriva sull'immagine non filtrata, quindi attivare i filtri. Regola il conteggio dei fotoni, la precisione di localizzazione, i sigma e l'indice del fotogramma, come menzionato nel manoscritto. Sovrapponi uno strumento di visualizzazione del piano X, Y, Z lungo l'asse X dei singoli veicoli elettrici dal campo visivo ed esporta i singoli file csv degli eventi di fotoregistrazione.

Taglia in due i singoli veicoli elettrici sull'asse X e Y in un campo visivo X per Y utilizzando uno strumento Istogramma linea, che inserisce gli eventi di foto commutazione in gruppi di distanza impostati. Scatta immagini di singoli veicoli elettrici e salvale come file tif. Crea video 3D di singoli veicoli elettrici utilizzando uno strumento di visualizzazione 3D e colora in base al posizionamento lungo l'asse Z.

A seguito della calibrazione del microscopio che ha prodotto un errore medio di 16 nanometri sull'asse X, Y e 38 nanometri sull'asse Z, i veicoli elettrici u20s purificati sono stati visualizzati con successo con una risoluzione fino a 20 nanometri sull'asse X, Y e 50 nanometri lungo l'asse Z. I singoli veicoli elettrici visualizzati tramite dSTORM in foto 3D sono stati commutati durante l'esposizione di 10.000 fotogrammi mentre la potenza del laser aumentava ed erano immediatamente evidenti nell'immagine acquisita. La correzione dell'immagine post-acquisizione nel piano Z, il conteggio dei fotoni, i sigma e la precisione di localizzazione dell'immagine ricostruita hanno portato a una chiara risoluzione dell'EV in 3D.

L'EV è stato fotografato solo durante i primi 7.000 fotogrammi, come si vede dalla leggenda nell'angolo in alto a destra. L'istogramma conferma che la maggior parte degli eventi di fotointerruttoria si è verificata entro un raggio di 100 nanometri, convalidando che l'EV visualizzato è un esosoma e che l'isolamento di veicoli elettrici di piccolo diametro ha avuto successo. L'analisi della distribuzione delle dimensioni eseguita su altri veicoli elettrici tracciati individualmente utilizzando lo strumento Istogramma di linea e lo strumento X, Y, Z-plane View ha confermato che la maggior parte degli eventi di fotointerruttoria si è verificata entro un raggio di 100 nanometri dal centro.

L'errore lungo l'asse Z è stato aumentato, producendo un'immagine finale allungata dell'EV lungo l'asse assiale. Gli eventi di fotointerruttoria non erano correlati alle dimensioni dei veicoli elettrici, dimostrando che la caratterizzazione basata su dSTORM può essere utilizzata per piccoli veicoli elettrici come esosomi e virus piccoli e avvolti di diametro inferiore a 100 nanometri. Durante l'esecuzione di dSTORM è importante ricordare di impostare la potenza laser iniziale molto bassa e sollevarla lentamente durante l'acquisizione dell'immagine per evitare il fotosbiancamento.

Fin dal suo sviluppo, dSTORM ha permesso ai ricercatori di comprendere meglio la morfologia delle strutture subcellulari che in precedenza erano impossibili da visualizzare a causa del limite di diffrazione della tipica microscopia ottica.