Quantificazione assoluta di inositolo pirofosfati mediante elettroforesi capillare Elettrospray ionizzazione spettrometria di massa

Questo fornisce risultati di alta qualità per il metabolismo del fosfato di inositolo in tutti gli organismi che abbiamo testato finora. Fornirà anche informazioni sul nuovo percorso biosintetico cellulare di cui siamo attualmente a conoscenza. Analisi del metabolismo dell'inositolo fosfato mediante CE-ESI-MS è più veloce, altamente sensibile, e in grado di fornire informazioni sulla struttura per gli assemblaggi di inositolo fosfato.

Per iniziare, impostare un sistema di spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray per elettroforesi capillare o CE-ESI-MS costituito da un sistema CE commerciale e uno spettrometro di massa tandem a triplo quadrupolo, dotato di una sorgente ESI Agilent Jet Stream. Quindi, collegare lo splitter 1:100 del flusso della guaina e l'uscita della pompa per cromatografia liquida isocratica e assicurarsi che il flaconcino di ingresso del sistema CE si trovi alla stessa altezza della punta dello spruzzatore dell'analizzatore di massa. Quindi, utilizzare la versione MassHunter Workstation o un software MS simile, per controllare l'intero sistema e l'acquisizione e l'analisi dei dati.

Dopo aver preparato il tampone di funzionamento CE e il liquido della guaina, installare il liquido della guaina spurgandolo a cinque millilitri al minuto per cinque minuti. Quindi impostare la portata su un millilitro al minuto e la pressione della pompa su 180 bar. Assicurarsi che il tubo riciclato si colleghi nuovamente alla bottiglia del liquido della guaina per riutilizzare il solvente.

Successivamente, utilizzando una fresa a colonna capillare con un disco diamantato rotante, tagliare correttamente entrambe le estremità di un capillare CE-MS con una finestra di rilevamento UV. Quindi rimuovere da due a tre centimetri di rivestimento in poliimmide su entrambe le estremità con un accendino e pulire la superficie capillare con isopropanolo. Per installare il capillare, abbinare il capillare nella cassetta CE-MS.

Quindi fare clic sul pulsante Cambia cassetta e installare la cassetta nel dispositivo CE. Per attivare il capillare, lavare prima il capillare con un idrossido di sodio molare, seguito da acqua per 10 minuti, quindi tampone CE per 15 minuti. Quindi, inserire il capillare nello spruzzatore CE-MS.

Utilizzando una lente d'ingrandimento e la vite di regolazione nello spruzzatore, regolare con precisione l'uscita capillare, assicurandosi che l'estremità capillare sporga di circa 0,1 millimetri dalla punta dello spruzzatore. Verificare la stabilità dello spruzzatore ESI in modalità Scansione completa. La fluttuazione degli elettroferogrammi ionici totali dovrebbe essere entro il 5% Quindi, eseguire un test con standard di inositolo fosfato.

Dopo aver preparato la miscela di standard interni, mescolare 10 microlitri del campione con 0,5 microlitri della miscela di standard interni e un flaconcino di campione CE. Quando si utilizza il sistema di rifornimento, fare clic sul pulsante Cambia bottiglia. Mettere i 250 millilitri preparati di tampone di funzionamento CE nella bottiglia dell'elettrolita.

Quindi fare clic su Clean Tubes mantenendo l'ago di rifornimento in una fiala d'acqua. Impostare i parametri ESI e MS. Quindi ottimizzare i parametri di origine utilizzando un ottimizzatore di origine con una miscela di standard di inositolo polifosfato e più impostazioni di monitoraggio delle reazioni utilizzando MassHunter Optimizer con tutti gli standard.

Successivamente, eseguire una corsa per gli estratti di fosfato di inositolo e controllare i risultati. Impostare una sequenza quando sono presenti più campioni. Dopo la misurazione, lasciare che la MS sia in modalità standby e non spegnere la pompa per cromatografia liquida.

Sostituire lo spruzzatore CE-ESI-MS con uno spruzzatore LC-ESI-MS quando non c'è alimentazione di liquido della guaina. Per l'analisi dei dati, aprire il software di analisi quantitativa e creare un batch per tutti i campioni. Successivamente, creare un nuovo metodo dai dati di monitoraggio delle reazioni multiple acquisiti e impostare i fosfati di inositolo di carbonio-13 come standard interni.

Quindi, controllare il composto di monitoraggio delle reazioni multiple, il tempo di ritenzione, gli standard interni, la concentrazione e la configurazione del qualificatore. Passare Validation and Exit per applicare il metodo al batch corrente. Salvare il metodo.

Quindi verificare se ogni picco nel batch è integrato correttamente. In caso contrario, integrare manualmente il picco. Esportare i risultati in un foglio di calcolo e quantificare i pirofosfati di inositolo, confrontando la risposta di picco dell'anolyte con la rispettiva risposta di picco degli standard interni marcati con isotopi stabili con concentrazioni note.

Infine, con la concentrazione misurata nel fosfato di inositolo, estrarre la soluzione e il suo volume, calcolare le quantità assolute e normalizzare ulteriormente la quantità per conteggio delle cellule o contenuto proteico. Calcolare la concentrazione cellulare in base alla conta cellulare e al volume medio delle cellule HCT116. Gli elettroferogrammi ionici estratti di inositolo pirofosfato standard ad una concentrazione di due micromoli sono mostrati qui.

Viene inserito il metabolismo dei pirofosfati di inositolo nei mammiferi con le loro strutture semplificate. Una serie CE-ESI-MS di cellule HCT116 dell'University College di Londra o UCL è mostrata qui. CE-MS è stato utilizzato per quantificare la variazione dei livelli di IP8 tra le cellule HCT116 di UCL e quelle di NIH.

Le celle HCT116 di UCL contengono livelli sette volte superiori di IP8 rispetto a quelli di NIH. L'accumulo significativo di 1, 5-IP8 nelle celle HCT116 UCL è parallelo a un notevole aumento di 1-IP7. L'analisi CE-ESI-MS di cellule HCT116 trattate con fluoruro di sodio da NIH ha dimostrato un aumento di 5-IP7, insieme a una riduzione di IP6 e un aspetto di 5-PPIP4.

Sebbene i livelli di 1-IP7 siano diminuiti in una certa misura, non è completamente assente nelle cellule trattate con fluoruro di sodio, ma per lo più sotto il limite di rilevazione. È importante formare un grado CE-ESI-MS stabile. Si consiglia di verificare la ripetibilità e la sensibilità del sistema prima delle misurazioni.

Questa tecnica consente di fornire metabolismo del fosfato di inositolo, impianti e tessuti, e forniscono anche l'opportunità di studiare da vicino il pirofosfato di inositolo biologicamente rilevante.