Name: Preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA codificanti aptameri e ribointerruttori RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Scopri come preparare microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA per biosensori in vitro. Questo metodo consente di studiare l'attivazione genica e i processi biologici a livello microscopico.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione LRIR 16RH3003J dell'Air Force Office of Scientific Research, nonché dal programma Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) dell'Ufficio del Sottosegretario alla Difesa degli Stati Uniti per la Ricerca e l'Ingegneria.
La sequenza del vettore plasmidico per ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) è stata generosamente fornita dal Dr. J. Gallivan. I bozzoli del baco da seta di Bombyx mori sono stati generosamente donati dal Dr. D.L. Kaplan della Tufts University, MA.

<ol><li>Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+devices+for+in+vitro+and+in+vivo+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).</li>
<li>Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitch-based+reversible+dual-color+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Riboswitch-based reversible dual-color sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).</li>
<li>König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genomics+and+synthetic+biology+applications+between+hopes+and+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns.</a> Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+An+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).</li>
<li>Chushak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synthetic+riboswitch+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems.</a> RNA Biology. , 1-12 (2021).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
<li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Grӓwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper-based%2C+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLoS One. 14 (3), 0210940(2019).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+environment-signal+detection+biosensors+with+cell-free+synthetic+biosystems%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems.</a> RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).</li>
<li>Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+compartmentalized+protein+synthesis+inside+double+emulsion+templated+liposomes+with+in+vitro+synthesized+and+assembled+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes.</a> Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
<li>Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+microcapsules%3A+Fresh+insights+and+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).</li>
<li>Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+and+structural+comparison+between+bright+and+dim+green+fluorescent+proteins+in+Amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus.</a> Scientific Reports. 4, 5469(2014).</li>
<li>Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrey%2C+B+%22Molecular+Diagnosis+of+Infectious+Diseases.+Methods+in+Molecular+Medicine%22">Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine</a>. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regeneration+and+reuse+of+silica+columns+from+PCR+purification+and+gel+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits.</a> Scientific Reports. 8, 12870(2018).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5%CE%B1-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), 0137466(2015).</li>
<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Drachuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+macromolecules+with+amino+acid-Poly%28Ethylene+Glycol%29+grafts+for+controlling+layer-by-layer+encapsulation+and+aggregation+of+recombinant+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells.</a> ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).</li>
<li>Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+multilayer+capsules+as+vehicles+with+tunable+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).</li>
<li>Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+activity+of+DNA-encoded+sensing+elements+through+confinement+in+silk+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).</li>
<li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+inhibition+of+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+layer-by-layer+assembly%3A+A+tribute+to+ACS+Nano+associate+editor+Helmuth+M%C3%B6hwald%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald.</a> ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).</li>
<li>Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-A+tool+for+structural+and+translational+DNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research.</a> APL Bioengineering. 5, 031504(2021).</li>
<li>Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+DNA+complexation+state+of+pBAE+polyplexes+in+cells+with+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy.</a> Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).</li>
<li>Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+of+nucleosome+core+particle+interactions+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans.</a> Scientific Reports. 8, 7046(2018).</li>
<li>Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+aspects+of+stabilization+of+compounds+in+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk.</a> Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).</li>
<li>Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+and+reducing+conditions+for+in+vitro+ribosome+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).</li>
<li>Ge, X., Luo, D., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+expression+under+macromolecular+crowding+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions.</a> PLoS One. 6 (12), 28707(2011).</li>
<li>Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+single+RNA+molecules+with+fluorogenic+mango+II+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays.</a> Nature Communications. 11, 1283(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li>
</ol>

I punti di vista e le opinioni qui presentati sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente i punti di vista del DoD o dei suoi componenti.

Le microcapsule di idrogel selettivamente permeabili caricate con vari tipi di sensori codificati dal DNA possono essere preparate seguendo questo protocollo. Una delle caratteristiche distintive dell'approccio LbL è la capacità di adattare la complessità delle microcapsule durante l'assemblaggio bottom-up, che di solito inizia con l'adsorbimento di specie molecolari su modelli sacrificali. Regolando attentamente le concentrazioni dei componenti iniziali, le condizioni di pH e il numero di strati, è possibile preparare m...

Il campo della biologia sintetica offre opportunità uniche per sviluppare capacità di rilevamento sfruttando meccanismi naturali evoluti dai microrganismi per monitorare il loro ambiente e le potenziali minacce. È importante sottolineare che questi meccanismi di rilevamento sono tipicamente legati a una risposta che protegge questi microrganismi dall'esposizione dannosa, regolando l'espressione genica per mitigare gli effetti negativi o prevenire l'assunzione di materiali tossici. Ci sono stati sforzi significativi per progettare questi microrganismi per creare sensori a cellule intere sfruttando queste risposte naturali ma reindirizzandoli a riconoscere nuovi bersagli e / o a produrre un segnale misurabile che può essere misurato a fini di quantificazione (tipicamente fluorescenza)1,2. Attualmente, le preoccupazioni relative all'uso di microrganismi geneticamente modificati (OGM), specialmente quando vengono rilasciati nell'ambiente o nel corpo umano, a causa della fuoriuscita di cellule intere o di parte del loro materiale genetico, anche se incapsulato in una matrice polimerica, suggeriscono che sono necessari modi alternativi per sfruttare questi approcci di rilevamento3.
Un approccio efficace per sfruttare i vantaggi del rilevamento basato su microrganismi senza preoccuparsi della diffusione di OGM è l'uso di sistemi di trascrizione/traduzione in vitro (IVTT). Da un punto di vista pratico, i sistemi IVTT consistono in una miscela contenente la maggior parte dei componenti cellulari in uno stato attivo che è stata "estratta" dalle cellule con diversi mezzi, tra cui sonicazione, battito di perline o altri4. Il prodotto finale di questo processo è una miscela di reazione biochimica già ottimizzata per eseguire la trascrizione e la traduzione che può essere utilizzata per testare diversi sensori in un formato "open vessel", senza i vincoli associati all'uso di cellule intere (diffusione di membrana, efficienza di trasformazione, tossicità cellulare, ecc.). È importante sottolineare che diversi componenti del sensore possono essere aggiunti quantitativamente e il loro effetto studiato con diverse tecniche ottiche e spettrometriche, come abbiamo dimostrato5. È stato notato che le prestazioni dei sistemi IVTT possono essere incoerenti; Tuttavia, studi recenti hanno mostrato approcci per standardizzare la loro preparazione e caratterizzazione, il che è di grande aiuto quando si studiano le loro prestazioni nella progettazione dei sensori6. Recentemente, sono stati dimostrati molti esempi di sistemi IVTT che utilizzano per creare saggi cartacei attraverso la liofilizzazione dei loro componenti in matrici cartacee, tra cui il rilevamento di ioni di metalli pesanti, farmaci, elementi di quorum sensing e altri 7,8,9. Uno spazio applicativo interessante per i sensori basati su IVTT è il loro utilizzo in applicazioni di rilevamento in diversi tipi di ambienti, tra cui suolo, acqua e corpo umano. Per distribuire questi sistemi IVTT in questi ambienti difficili, è necessario implementare un approccio di incapsulamento per contenere i componenti IVTT e proteggerli dal degrado.
Gli approcci di incapsulamento più comuni per i sistemi IVTT includono l'uso di capsule lipidiche, micelle, polimerisomi e altri microcontenitori strettamente chiusi10,11,12. Uno svantaggio di questo approccio è la necessità di incorporare meccanismi passivi o attivi per trasportare materiali dentro e fuori i contenitori per consentire la comunicazione con l'ambiente esterno e fornire capacità di rilevamento. Per superare alcuni di questi problemi, lo studio riporta un metodo che fornisce un approccio semplice ma efficace per incapsulare i materiali di codifica per diversi progetti di sensori da esprimere nei sistemi IVTT. Questo approccio si basa sull'utilizzo della deposizione Layer-by-Layer (LbL) di un biopolimero in presenza dei plasmidi di interesse per creare microcapsule cave ad alta porosità, che consente al materiale genetico protetto di interagire con i diversi componenti dell'IVTT di scelta. Lo studio ha dimostrato che i plasmidi incapsulati potrebbero dirigere la trascrizione e la traduzione quando attivati all'interno di questa matrice polimerica, come mostrato con la risposta di un aptamero codificato da plasmide e di un riboswitch ai loro bersagli corrispondenti. Inoltre, questo rivestimento LbL protegge i plasmidi per mesi senza particolari condizioni di conservazione.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-difluoro-4-idrossibenzilidene)-2-metil-1-(2,2,2-trifluoroetil)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T)</td><td>Lucerna</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5x T4 DNA ligasi tampone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6x colorante di caricamento su gel blu</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti, circolari nere</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>BioReagent, per biologia molecolare,</td></tr><tr><td>sale sodico di ampicillina</td> a basso EEO <td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>polvere o cristalli, BioReagent, adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>Enzimi di restrizione BlpI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0585S</td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtro sottovuoto monouso / Sistemi di stoccaggio</td><td>FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido, DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>reagente ACS, &ge; 99,9%</td></tr><tr><td>Plasmide di DNA, pET28c-F30-2x Broccoli (5,4 kb), BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #66788</td><td></td></tr><tr><td>DyLightTM550 Kit di marcatura degli anticorpi (Invitrogen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di estrazione di E. coli S30 per DNA circolare</td><td>Provette</td> da centrifuga coniche Promega <td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche Falcon, 50 mL</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Provette per microcentrifuga, 1,5 mL</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Acido fluoridrico, reagente HF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695068</td><td>ACS, 48%</td></tr> <tr><td>di Kanamicina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>miscela di Kanamicina A (componente principale) e Kanamicina B e C</td></tr><tr><td>Enzimi di restrizione KpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di agar LB integrata con 100 &micro; g/mL di ampicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>piastre di agar pre-versate con 100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>di piastra agar ampicillina LB integrata con 50 &micro; g/mL di kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0543</td><td>piastre di agar pre-versate con 50 &micro; g/mL di brodo di kanamicina</td></tr><tr><td>LB (grado Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di litio, LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td>ReagentPlus, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Efficienza massima DH5-&alfa; ceppo di E. coli competente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>MilliporeSigma</td><td>322415</td><td>anidro, 99,8%</td></tr><tr><td>MilliQ-acqua</td><td>EMD MilliPore</td><td></td><td>Milli-Q Sistema di purificazione dell'acqua di riferimento</td></tr><tr><td>MinElute Kit di purificazione PCR</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimetilamminopropil)-N&prime;-etilcarbodiimmide cloridrato, EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>ThermoFisher Scientific 10010023</td><td></td><td>1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina,</td><td>Sigma-Aldrich</td> ramificato <td>408727</td><td>Mw medio ~25.000</td></tr><tr><td>Kit di sintesi proteica in vitro PURExpress Kit di estrazione su</td> gel <td>New England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>Kit di miniprep QIAprep Spin</td><td>Qiagen</td><td> 27104</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA a 2 log a caricamento rapido (0,1-10,0 kb)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO? Microsfere di silice, 4,0 &; m</td><td>Poliscienze, Inc.</td><td>24331-15</td><td>Soluzione acquosa al 10%</td></tr><tr><td>Cassette per dialisi Slide-A-Lyzer G2, 3,5K MWCO, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio, Na?CO?</td><td>Sigma-Aldrich 222321</td><td></td><td>reagente ACS, anidro, &ge; 99,5%, polvere</td></tr><tr><td>Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dispositivi per dialisi</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spettro G235058</td></tr><tr><td>SYBR Sicuro DNA gel colorante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi (5 U/&micro; L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Teofillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633</td><td>anidra, &ge; 99%, polvere</td></tr><tr><td>Tris acetato-tampone EDTA (tampone TAE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td>Contiene 40 mM di Tris-acetato e 1 mM di EDTA, pH 8,3.</td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi</td><td>FisherScientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>Kit MaxiPrep per plasmidi ZymoPURE II</td><td>ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di dna codificanti aptameri e ribointerruttori rna

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

Introduciamo un protocollo per la preparazione di microcapsule di fibroina di seta cariche di DNA tramite il metodo di assemblaggio Layer-by-Layer (LbL) su nuclei sferici sacrificali. Dopo l'adsorbimento di uno strato primario e plasmidi di DNA, la formazione di microcapsule robuste è stata facilitata inducendo fogli di β nella struttura secondaria della seta durante la disidratazione acuta di un singolo strato di seta. Quindi, la stratificazione è avvenuta tramite legami idrogeno multipli e interazioni idrofobiche. Dopo l'adsorbimento di gusci multistrato, le strutture del guscio centrale possono essere ulteriormente funzionalizzate con nanoparticelle d'oro (AuNP) e / o anticorpi (IgG) da utilizzare per il telerilevamento e / o la consegna mirata. La regolazione di diversi parametri chiave durante la deposizione sequenziale di macromolecole chiave su nuclei di silice come la presenza di un primer polimerico, la concentrazione di DNA e proteine della seta, nonché un numero di strati adsorbiti ha portato a microcapsule biocompatibili, cariche di DNA con permeabilità e carichi di DNA variabili. Dopo la dissoluzione dei nuclei di silice, il protocollo ha dimostrato la formazione di microcapsule cave e robuste con plasmidi di DNA immobilizzati sulla superficie interna della membrana della capsula. La creazione di una membrana biocompatibile selettivamente permeabile tra i plasmidi del DNA e l'ambiente esterno ha preservato il DNA durante la conservazione a lungo termine e ha svolto un ruolo importante nel miglioramento della risposta di uscita dai plasmidi spazialmente confinati. L'attività dei modelli di DNA e la loro accessibilità sono state testate durante le reazioni di trascrizione e traduzione in vitro (sistemi cell-free). I plasmidi del DNA che codificano aptameri e riboswitch di illuminazione dell'RNA sono stati attivati con successo con analiti corrispondenti, come è stato visualizzato durante la localizzazione di trascritti di RNA marcati con fluorescenza o proteina GFPa1 nelle membrane del guscio.

Qui, lo studio affronta la funzionalità dei modelli di DNA che codificano diversi design di sensori (due tipi di elementi di trascrizione/traduzione regolati dall'RNA) dopo l'incapsulamento in capsule proteiche della seta. Le microcapsule sono state preparate tramite un assemblaggio Layer-by-Layer (LbL) modellato dei componenti chiave: uno strato primo, plasmidi di DNA che codificano i progetti dei sensori e biopolimero di fibroina di seta (Figura 2). La deposizione di macromolecole in modo ...

Il protocollo descrive la formazione di microcapsule robuste e biocompatibili cariche di DNA come biosensori in vitro multiplex in grado di tracciare diversi ligandi.

Preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA codificanti aptameri e ribointerruttori RNA

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

Il significato di questo protocollo è che fornisce un mezzo per mantenere funzionali i sensori codificati nel DNA, immobilizzando i modelli di plasmidi di DNA in microcapsule biocompatibili semipermeabili. La tecnica di immobilizzazione del DNA proposta è versatile. Consente la fabbricazione di biosensori multifunzionali con diversi meccanismi di attivazione in vitro.Immaginiamo che queste microcapsule, abbinate agli elementi di rilevamento appropriati, potrebbero essere utilizzate per studiare diversi processi biologici, incluso il rilascio di molecole di segnalazione in diversi ambienti come biofilm e organi. Questa tecnica può fornire informazioni sui sistemi biologici su microscala, in particolare su come l'immobilizzazione del DNA e l'affollamento molecolare possono influenzare la cinetica e il meccanismo di attivazione genica. Iniziare con la deposizione dello strato primario di polietilenimmina sulle microparticelle di silice sacrificale, o SiO2, aggiungendo un millilitro di soluzione di polietilenimmina a 300 microlitri di microparticelle in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.Agitare la miscela su un ThermoMixer a 800 rotazioni al minuto in condizioni ambientali. Raccogliere le microparticelle mediante centrifugazione a 0,2 g per un minuto a temperatura ambiente e rimuovere con cura il surnatante. Dopo 15 minuti, lavare le microparticelle quattro volte con un millilitro di acqua deionizzata priva di DNasi e RNasi mediante centrifugazione a 0,2 g per un minuto a temperatura ambiente, scartando il surnatante dopo ogni centrifugazione.Successivamente, regolare la concentrazione di plasmidi di DNA da 50 a 200 nanogrammi per microlitri con acqua distillata priva di DNasi e RNasi e utilizzare un millilitro delle soluzioni preparate per depositare il DNA sulle microparticelle innescate con polietilenimmina. Agitare delicatamente la miscela di microparticelle su un ThermoMixer a quattro gradi Celsius e 800 giri/min per 15 minuti, quindi raccogliere le microparticelle mediante centrifugazione a 0,2 g per un minuto. Marcare le provette per i plasmidi di DNA che codificano per il riboswitch della teofillina, accoppiati con GFPa1 come ThyRS-GFPa1, e i plasmidi di DNA che codificano per l'aptamero di broccoli come BrocApt.Rimuovere con cura il surnatante e lavare le microparticelle quattro volte con un millilitro di acqua distillata priva di DNasi e RNasi, come precedentemente dimostrato, scartando il surnatante dopo ogni centrifugazione. Per depositare lo strato di fibroina di seta, aggiungere un millilitro della soluzione acquosa di fibroina di seta ricostituita alle microparticelle assorbite dal DNA e agitare delicatamente la miscela sul ThermoMixer a 750 giri/min per 15 minuti a 10 gradi Celsius. Raccogliere le microparticelle mediante centrifugazione, quindi lavarle una volta con un millilitro di acqua distillata priva di DNasi e RNasi, come spiegato in precedenza.Ripetere la centrifugazione e scartare il surnatante. Aggiungere 0,5 millilitri di DNasi e RNasi di acqua distillata e mescolare le microparticelle mediante vortex. Quindi, trattare le microparticelle con 0,5 millilitri di metanolo al 100% a 10 gradi Celsius per cinque minuti su un ThermoMixer.Dopo aver raccolto le microparticelle mediante centrifugazione, trattare le particelle con metanolo al 100% sul ThermoMixer a 750 rotazioni al minuto per 10 minuti a 10 gradi Celsius per la formazione di fogli beta. Centrifugare la miscela a 0,2 g per un minuto a quattro gradi Celsius per raccogliere le microparticelle prima di lavare le particelle due volte con un millilitro di acqua distillata priva di DNasi e RNasi, come dimostrato in precedenza. Sciogliere i nuclei di SiO2 delle microparticelle aggiungendo una soluzione di acido fluoridrico all'8% alle microparticelle del guscio del nucleo pellettato.Trasferire le soluzioni di particelle disciolte nei dispositivi di dialisi e dializzarle contro l'acqua deionizzata in un becher. Quindi, utilizzare una pipetta da un millilitro per raccogliere la sospensione di microcapsule di seta dai dispositivi di dialisi in nuove provette per microcentrifuga da due millilitri. Trasferire 100 microlitri del campione della microcapsula in un singolo pozzetto di vetrini a camera da otto pozzetti e lasciare sedimentare le capsule per 20-30 minuti prima dell'imaging utilizzando un microscopio a scansione laser confocale o CLSM.Pipettare 100 microlitri della sospensione di capsule in ciascun pozzetto di un vetrino a camera. A ciascun pozzetto, aggiungere in sequenza 300 microlitri di soluzione di fluoroforo di peso molecolare variabile dal più basso al più alto. Miscelare la miscela pipettandola su e giù e lasciarla incubare per un'ora a temperatura ambiente fino a quando la diffusione delle soluzioni fluorofore raggiunge l'equilibrio.Successivamente, trasferire il vetrino su un CLSM per visualizzare ogni pozzetto utilizzando un obiettivo a immersione in olio 100x a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri. Identifica l'area di interesse regolando il piano focale e concentrati sulle capsule che appaiono sotto forma di cerchi del diametro maggiore. Eseguire la reazione di trascrizione/traduzione in vitro aggiungendo in sequenza i componenti privi di cellule a un campione di microcapsule e incubando la provetta a 30 gradi Celsius per quattro ore.Controllare la fluorescenza su un lettore di piastre utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione a 488 nanometri e l'emissione per il filtro GFP/FITC a circa 510 nanometri. Infine, è possibile visualizzare le microcapsule di seta sul sistema CLSM utilizzando laser a 488 e 561 nanometri. Nello studio sono stati prodotti robusti microcondensatori in fibroina di seta con una dimensione omogenea di circa 4,5 micrometri e uno spessore del guscio di circa 500 nanometri.La permeabilità degli involucri delle capsule cave di fibroina di seta è stata analizzata seguendo il metodo del cutoff del peso molecolare. Un aumento della concentrazione di uno strato primario di polietilenimmina porta ad una maggiore stabilità colloidale delle microcapsule con gusci più permeabili, mentre l'eliminazione dello strato primario provoca l'aggregazione delle capsule con membrane del guscio meno permeabili. La cinetica di espressione di GFPa1 durante l'attivazione di ThyRS ha rivelato una maggiore attivazione del gene GFPa1 dai plasmidi di DNA caricati in microcapsule di seta rispetto al DNA di controllo non incapsulato.Nell'analisi rappresentativa, vengono visualizzate immagini CLSM di capsule di fibroina di seta caricate con 32 copie di DNA per capsula prima e dopo l'incubazione nel sistema di traduzione in vitro. I profili di intensità della sezione trasversale delle capsule di fibroina di seta hanno dimostrato l'espressione di GFPa1. La cinetica di trascrizione di 20 microcapsule di seta stratificate caricate con 30 copie di DNA per capsula è stata confrontata con il DNA non incapsulato di controllo.Il segnale di uscita più elevato delle microcapsule di seta rispetto ai campioni di DNA non incapsulati di concentrazioni equivalenti ha confermato l'efficacia delle microcapsule di seta. Seguendo questo protocollo, diverse tecniche di microscopia ad alta risoluzione possono essere applicate all'entanglement del DNA dell'immagine nello stato immobilizzato e al processo di attivazione genica disaccoppiata in vitro. Questa tecnica può essere applicata per rispondere alle dinamiche a livello molecolare in cellule artificiali minime.In particolare, se abbinate a elementi genici adeguati, le microcapsule possono essere utilizzate per studiare la comunicazione da cellula a cellula.

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Preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA codificanti aptameri e ribointerruttori RNA

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