Preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA codificanti aptameri e ribointerruttori RNA

Il significato di questo protocollo è che fornisce un mezzo per mantenere funzionali i sensori codificati nel DNA, immobilizzando i modelli di plasmidi di DNA in microcapsule biocompatibili semipermeabili. La tecnica di immobilizzazione del DNA proposta è versatile. Consente la fabbricazione di biosensori multifunzionali con diversi meccanismi di attivazione in vitro.

Immaginiamo che queste microcapsule, abbinate agli elementi di rilevamento appropriati, potrebbero essere utilizzate per studiare diversi processi biologici, incluso il rilascio di molecole di segnalazione in diversi ambienti come biofilm e organi. Questa tecnica può fornire informazioni sui sistemi biologici su microscala, in particolare su come l'immobilizzazione del DNA e l'affollamento molecolare possono influenzare la cinetica e il meccanismo di attivazione genica. Iniziare con la deposizione dello strato primario di polietilenimmina sulle microparticelle di silice sacrificale, o SiO2, aggiungendo un millilitro di soluzione di polietilenimmina a 300 microlitri di microparticelle in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.

Agitare la miscela su un ThermoMixer a 800 rotazioni al minuto in condizioni ambientali. Raccogliere le microparticelle mediante centrifugazione a 0,2 g per un minuto a temperatura ambiente e rimuovere con cura il surnatante. Dopo 15 minuti, lavare le microparticelle quattro volte con un millilitro di acqua deionizzata priva di DNasi e RNasi mediante centrifugazione a 0,2 g per un minuto a temperatura ambiente, scartando il surnatante dopo ogni centrifugazione.

Successivamente, regolare la concentrazione di plasmidi di DNA da 50 a 200 nanogrammi per microlitri con acqua distillata priva di DNasi e RNasi e utilizzare un millilitro delle soluzioni preparate per depositare il DNA sulle microparticelle innescate con polietilenimmina. Agitare delicatamente la miscela di microparticelle su un ThermoMixer a quattro gradi Celsius e 800 giri/min per 15 minuti, quindi raccogliere le microparticelle mediante centrifugazione a 0,2 g per un minuto. Marcare le provette per i plasmidi di DNA che codificano per il riboswitch della teofillina, accoppiati con GFPa1 come ThyRS-GFPa1, e i plasmidi di DNA che codificano per l'aptamero di broccoli come BrocApt.

Rimuovere con cura il surnatante e lavare le microparticelle quattro volte con un millilitro di acqua distillata priva di DNasi e RNasi, come precedentemente dimostrato, scartando il surnatante dopo ogni centrifugazione. Per depositare lo strato di fibroina di seta, aggiungere un millilitro della soluzione acquosa di fibroina di seta ricostituita alle microparticelle assorbite dal DNA e agitare delicatamente la miscela sul ThermoMixer a 750 giri/min per 15 minuti a 10 gradi Celsius. Raccogliere le microparticelle mediante centrifugazione, quindi lavarle una volta con un millilitro di acqua distillata priva di DNasi e RNasi, come spiegato in precedenza.

Ripetere la centrifugazione e scartare il surnatante. Aggiungere 0,5 millilitri di DNasi e RNasi di acqua distillata e mescolare le microparticelle mediante vortex. Quindi, trattare le microparticelle con 0,5 millilitri di metanolo al 100% a 10 gradi Celsius per cinque minuti su un ThermoMixer.

Dopo aver raccolto le microparticelle mediante centrifugazione, trattare le particelle con metanolo al 100% sul ThermoMixer a 750 rotazioni al minuto per 10 minuti a 10 gradi Celsius per la formazione di fogli beta. Centrifugare la miscela a 0,2 g per un minuto a quattro gradi Celsius per raccogliere le microparticelle prima di lavare le particelle due volte con un millilitro di acqua distillata priva di DNasi e RNasi, come dimostrato in precedenza. Sciogliere i nuclei di SiO2 delle microparticelle aggiungendo una soluzione di acido fluoridrico all'8% alle microparticelle del guscio del nucleo pellettato.

Trasferire le soluzioni di particelle disciolte nei dispositivi di dialisi e dializzarle contro l'acqua deionizzata in un becher. Quindi, utilizzare una pipetta da un millilitro per raccogliere la sospensione di microcapsule di seta dai dispositivi di dialisi in nuove provette per microcentrifuga da due millilitri. Trasferire 100 microlitri del campione della microcapsula in un singolo pozzetto di vetrini a camera da otto pozzetti e lasciare sedimentare le capsule per 20-30 minuti prima dell'imaging utilizzando un microscopio a scansione laser confocale o CLSM.

Pipettare 100 microlitri della sospensione di capsule in ciascun pozzetto di un vetrino a camera. A ciascun pozzetto, aggiungere in sequenza 300 microlitri di soluzione di fluoroforo di peso molecolare variabile dal più basso al più alto. Miscelare la miscela pipettandola su e giù e lasciarla incubare per un'ora a temperatura ambiente fino a quando la diffusione delle soluzioni fluorofore raggiunge l'equilibrio.

Successivamente, trasferire il vetrino su un CLSM per visualizzare ogni pozzetto utilizzando un obiettivo a immersione in olio 100x a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri. Identifica l'area di interesse regolando il piano focale e concentrati sulle capsule che appaiono sotto forma di cerchi del diametro maggiore. Eseguire la reazione di trascrizione/traduzione in vitro aggiungendo in sequenza i componenti privi di cellule a un campione di microcapsule e incubando la provetta a 30 gradi Celsius per quattro ore.

Controllare la fluorescenza su un lettore di piastre utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione a 488 nanometri e l'emissione per il filtro GFP/FITC a circa 510 nanometri. Infine, è possibile visualizzare le microcapsule di seta sul sistema CLSM utilizzando laser a 488 e 561 nanometri. Nello studio sono stati prodotti robusti microcondensatori in fibroina di seta con una dimensione omogenea di circa 4,5 micrometri e uno spessore del guscio di circa 500 nanometri.

La permeabilità degli involucri delle capsule cave di fibroina di seta è stata analizzata seguendo il metodo del cutoff del peso molecolare. Un aumento della concentrazione di uno strato primario di polietilenimmina porta ad una maggiore stabilità colloidale delle microcapsule con gusci più permeabili, mentre l'eliminazione dello strato primario provoca l'aggregazione delle capsule con membrane del guscio meno permeabili. La cinetica di espressione di GFPa1 durante l'attivazione di ThyRS ha rivelato una maggiore attivazione del gene GFPa1 dai plasmidi di DNA caricati in microcapsule di seta rispetto al DNA di controllo non incapsulato.

Nell'analisi rappresentativa, vengono visualizzate immagini CLSM di capsule di fibroina di seta caricate con 32 copie di DNA per capsula prima e dopo l'incubazione nel sistema di traduzione in vitro. I profili di intensità della sezione trasversale delle capsule di fibroina di seta hanno dimostrato l'espressione di GFPa1. La cinetica di trascrizione di 20 microcapsule di seta stratificate caricate con 30 copie di DNA per capsula è stata confrontata con il DNA non incapsulato di controllo.

Il segnale di uscita più elevato delle microcapsule di seta rispetto ai campioni di DNA non incapsulati di concentrazioni equivalenti ha confermato l'efficacia delle microcapsule di seta. Seguendo questo protocollo, diverse tecniche di microscopia ad alta risoluzione possono essere applicate all'entanglement del DNA dell'immagine nello stato immobilizzato e al processo di attivazione genica disaccoppiata in vitro. Questa tecnica può essere applicata per rispondere alle dinamiche a livello molecolare in cellule artificiali minime.

In particolare, se abbinate a elementi genici adeguati, le microcapsule possono essere utilizzate per studiare la comunicazione da cellula a cellula.