Name: Adattamento degli organoidi gastrointestinali per linfezione da agenti patogeni e il sequenziamento di singole cellule in condizioni di livello di biosicurezza 3 (BSL-3) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Scopri come infettare organoidi intestinali umani per studiare le interazioni ospite-patogeno a livello di singola cellula con sequenziamento scRNA-seq. Questo metodo BSL-3 rivela risposte immunitarie specifiche.

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Megan Stanifer e Steeve Boulant sono state sostenute da borse di ricerca della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (numero di progetto 240245660, 278001972, 415089553 e 272983813 a Steeve Boulant e 416072091 a Megan Stanifer), allo stato del Baden-Wuerttemberg e al Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B a MS e 01KI20198A e (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) a SB. Gli schemi sono stati creati in BioRender.

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Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

I patogeni enterici iniziano più spesso il loro ciclo di vita infettando le cellule epiteliali intestinali dal loro lato apicale rivolto verso il lume dell'intestino. Mentre gli organoidi sono ben riconosciuti come un buon modello per riprodurre la complessità cellulare e l'organizzazione dell'epitelio intestinale, la loro organizzazione come strutture tridimensionali e chiuse rende la loro membrana apicale inaccessibile al patogeno. Questo protocollo descriveva metodi per infettare gli organoidi intestinali dal loro lato apicale, dal loro lato basolaterale o da entrambi con patogeni BLS-3. Questi protocolli possono essere facilmente adattati per studiare qualsiasi agente patogeno enterico sotto il contenimento BSL-2 o BLS-3 o qualsiasi altro modello organoide seguendo alcuni passaggi critici evidenziati di seguito. Il metodo sopra descritto è per l'isolamento e la preparazione di goccioline a cellula singola in conformità con le normative in Germania. Come dichiarazione di non responsabilità, questo protocollo non descrive le misure di gestione della biosicurezza (procedure operative standard) che devono essere adottate mentre si lavora in condizioni BSL-3. È anche importante insistere sul fatto che le normative possono variare in altri paesi e che le autorità locali devono essere contattate per assicurarsi che tutte le normative locali siano rispettate.
Uno dei passaggi critici nella semina di organoidi in due dimensioni per l'infezione apicale è il controllo che le cellule si differenzino in modo simile rispetto a quando vengono coltivate come organoidi tridimensionali classici. A seconda del patogeno enterico, il tropismo potrebbe essere limitato a cellule molto rare o a cellule che devono essere altamente differenziate. In questo caso, l'utilizzo di un organoide bidimensionale che non si differenzia completamente potrebbe comportare l'errata conclusione che questo patogeno enterico non possa infettare gli organoidi intestinali. Si suggerisce, se possibile, di eseguire infezioni utilizzando le tre configurazioni di questo protocollo: organoide 2D solo per l'infezione apicale (sezione 2), organoidi 3D aperti crackati per infezione apicale e basolaterale (sezione 3) e organoidi 3D completi solo per l'infezione basolaterale (sezione 3). Questo approccio aiuterà a discernere la via di ingresso del patogeno (apicale vs basolaterale) e controllerà anche che sia stato raggiunto un livello simile di differenziazione. Un'alternativa per l'infezione apicale 2D è la microiniezione, che utilizzerà un organoide 3D ma consegnerà l'agente patogeno direttamente nel lato apicale (vedi Bartfeld et al.27 per i dettagli). Questo metodo richiede un iniettore esperto per garantire che l'agente patogeno sia posizionato correttamente e che gli organoidi rimangano intatti. La microiniezione è comunemente usata nel contenimento di BSL-2 e potrebbe non essere adatta per il contenimento di BSL-3.
Un'ulteriore considerazione importante quando si eseguono esperimenti di infezione in organoidi seminati 2D è la densità cellulare finale. Come accennato nel passaggio 2.3, 100-150 organoidi saranno seminati in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti o in un pozzo di una slitta a camera di vetro a 8 pozzetti. A seconda della linea organoide e della persona che maneggia gli organoidi, la dimensione di questi organoidi può essere significativamente diversa. Ciò potrebbe comportare densità cellulari molto diverse nella piastra a 48 pozzetti o nella slitta della camera con fondo di vetro a 8 pozzetti. A seconda del virus enterico, alcuni virus preferiscono cellule più sparse, mentre altri saranno anche in grado di infettare le cellule confluenti. L'origine molecolare di tali differenze di infettività per diverse confluenze cellulari non è chiara; pertanto, gli esperimenti pilota volti a trovare la migliore densità cellulare per il patogeno enterico di scelta dovrebbero essere eseguiti prima di eseguire un'ulteriore caratterizzazione a valle.
Spesso lo smistamento FACS viene eseguito prima di eseguire l'emulsione di goccioline a cellula singola. Questo passaggio viene spesso utilizzato per separare le cellule morte da quelle vive e le singole cellule dai doppietti. Quando si lavora con agenti patogeni BSL-3, è necessario che la struttura sia dotata di un selezionatore FACS appropriato, il che non accade spesso. Inoltre, non tutte le cellule di un organoide hanno le stesse dimensioni ed è spesso difficile discriminare tra un doppietto o una cellula più grande, causando così il rischio di selezionare negativamente un tipo di cellula specifico. Inoltre, c'è ancora discussione sul campo se il tempo necessario per l'ordinamento tra 5.000-10.000 per ciascun campione possa comportare una modifica significativa del profilo di trascrizione delle singole celle. Mentre sono stati descritti metodi di fissazione cellulare compatibili con il sequenziamento a singola cellula (ad esempio, metanolo e RNAassist), è stato osservato che ciò porta ad una diminuzione della qualità del sequenziamento18. Infine, si sospetta che lo smistamento delle cellule utilizzando marcatori di morte cellulare possa anche portare a un pregiudizio. Data la proliferazione direzionale e la differenziazione delle cellule attraverso l'asse cripto-villi, le cellule più differenziate, che stanno per essere liberate e rilasciate, si trovano sulla punta dei villi. Queste cellule sono spesso positive per diversi marcatori delle vie di morte cellulare (adesempio, apoptosi, necrosi e necroptosi); tuttavia, quando si osserva l'infezione da rotavirus dell'intestino del topo, la punta dei villi è l'area più infetta28. Pertanto, filtrare le cellule che possono sembrare positive per i marcatori di morte comporterebbe una selezione negativa delle cellule infette che possono rappresentare l'infezione fisiologica. Attualmente, non esiste una buona soluzione per lo smistamento e il fissaggio degli organoidi prima del sequenziamento a singola cellula. Si raccomanda l'uso di cellule vive e non selezionate in quanto sono necessari ulteriori studi per trovare protocolli alternativi adatti.
Il sequenziamento a singola cellula ha rivoluzionato il modo in cui le risposte cellulari possono essere valutate. Questa tecnica consente l'identificazione di risposte specifiche del lignaggio cellulare sia in condizioni basali che sotto infezioni patogene. Questo metodo ha aperto porte in molti campi che in precedenza erano limitati da letture di massa. Mentre questo metodo è molto potente, ha i suoi limiti. Una limitazione chiave è l'ampia analisi bioinformatica richiesta a valle del sequenziamento. Ciò è particolarmente importante quando si analizzano i tessuti e si assegnano tipi di cellule in cui attualmente non vi è alcuna annotazione. Avere un bioinformatico esperto è necessario per supportare tutti gli studi su singole cellule.
Questo protocollo descrive come seminare e gestire gli organoidi intestinali umani, infettarli con agenti patogeni enterici ed eseguire scRNAseq. Adattare questo approccio ad altri organi è ora possibile, poiché per la maggior parte degli organi sono stati sviluppati sistemi di modelli organoidi. Gli organoidi polmonari ed epatici sono organizzati in modo simile rispetto agli organoidi intestinali e, come tali, l'uso di un approccio analogo potrebbe essere trasposto a questi organoidi. Il controllo critico sarà quello di convalidare che quando vengono coltivati in due dimensioni o aperti, questi organoidi raggiungono una differenziazione simile a quella delle loro controparti organoidi 3D. Le caratteristiche specifiche e i geni che definiscono uno stato differenziato sono specifici per ciascun modello di organo. Altri modelli organoidi come gli organoidi renali e vascolari, grandi strutture dense, avranno bisogno di metodi aggiuntivi per dissociare serialmente queste strutture in singole cellule.

Studiare il tropismo specifico del tipo cellulare e la risposta immunitaria specifica del tipo cellulare ai virus enterici umani è stato storicamente impegnativo a causa della mancanza di modelli cellulari umani primari. Questa limitazione è stata ora parzialmente sradicata con lo sviluppo di organoidi1. Nel caso del tratto gastrointestinale, sono stati sviluppati modelli organoidi gastrici e intestinali per l'uomo e diverse altre specie (adesempio, murine, bovine, feline, pipistrelli)2,3,4,5,6. Gli organoidi intestinali riproducono l'architettura strutturale dell'epitelio intestinale umano e contengono strutture simili a cripte e villi, lignaggi intestinali funzionali e sono stati persino utilizzati per identificare lignaggi cellulari precedentemente sconosciuti. Due diversi approcci possono essere utilizzati per coltivare organoidi intestinali. In primo luogo, le cellule staminali intestinali contenenti cripte vengono isolate da resezioni tissutali o biopsie e coltivate in condizioni di coltura specifiche (ad esempio, Wnt3A, R-spondin, Noggin ed EGF) per espandersi, e quindi differenziare le cellule staminali dalla maggior parte delle linee cellulari intestinali (adesempio, enterociti, cellule paneth, cellule calici, cellule enteroendocrine)7. Questo metodo consente l'isolamento degli organoidi da tutte le sezioni del tratto gastrointestinale (adesempio,stomaco, duodeno, digiuno, ileo e colon). Il secondo metodo si basa su cellule staminali pluripotenti o embrionali indotte dall'uomo, che vengono poi differenziate in un processo graduale in cellule epiteliali intestinali8. Questi organoidi indotti a base di cellule staminali sono spesso descritti come di natura più embrionale rispetto agli organoidi derivati dal paziente. Mentre tutti questi modelli organoidi sono stati fondamentali per svelare i segnali di sviluppo necessari per formare il tratto intestinale, il loro uso nella ricerca sulle malattie infettive è ancora agli inizi.
Virus enterico è un termine ampio che copre tutti i virus, che infettano attraverso il tratto gastrointestinale, come picornavirus (adesempio,EV-71), reovirus (ad esempio, rotavirus) e calicivirus (ad esempio, norovirus)9. I virus enterici iniziano il loro ciclo di vita infettivo attraverso l'ingestione di cibo e acqua contaminati, che lascia le persone nei paesi in via di sviluppo ad alto rischio a causa dello scarico di rifiuti non trattati nell'ambiente e della mancanza di cure mediche dopo l'insorgenza dell'infezione10. A seconda del tipo di agente patogeno, l'infezione può portare a gastroenterite, vomito e / o diarrea acquosa a causa della perdita del rivestimento intestinale. I norovirus umani sono un patogeno enterico altamente diffuso e altamente infettivo, che porta a oltre 600 milioni di infezioni e 15 milioni di ricoveri in tutto il mondo11. Gli organoidi sono stati fondamentali per la ricerca sul norovirus in quanto supportano l'infezione e la replicazione del norovirus umano, che in precedenza non era in grado di essere coltivato in modelli di coltura cellulare standard12.
Negli ultimi due decenni, i coronavirus sono emersi come patogeni umani chiave13. Questa famiglia comprende i MERS ad alta patogenicità, SARS-CoV-1 e SARS-CoV-2, che richiedono rigorosi livelli di sicurezza quando si eseguono ricerche su questi virus. È interessante notare che, mentre tutti e tre questi agenti patogeni sono per lo più riconosciuti per i loro sintomi respiratori indotti e distress, è ora evidente che questi virus non infettano solo le vie respiratorie ma anche altri organi. Un'importante patologia indotta nei pazienti infetti da SARS-CoV-2 oltre al distress respiratorio è la presenza di sintomi gastrointestinali14. Una frazione dei pazienti infetti da SARS-CoV-2 mostra tali sintomi, che vanno da diarrea molto lieve a grave. Inoltre, i genomi SARS-CoV-2 possono essere rilevati nelle biopsie delle feci e del tratto gastrointestinale di pazienti infetti15. È importante sottolineare che la presenza di sintomi gastrointestinali non è limitata a SARS-CoV-2 come sono stati osservati anche in pazienti con infezione da MERS e SARS-CoV-1. Per capire come SARS-CoV-2 induce disturbi gastrointestinali e identificare con precisione il tropismo di SARS-CoV-2 nel tratto gastrointestinale, gli organoidi intestinali umani sono stati uno strumento chiave e sono ora sfruttati per svelare le risposte specifiche del tipo cellulare a questo patogeno16,17.
Il profilo trascrizionale di una popolazione cellulare (sequenziamento dell'RNA di massa) è stata una pratica standard quando si valutano le infezioni patogene sia di linee cellulari immortalizzate che con organoidi. Mentre questo ci consente di determinare i cambiamenti globali in risposta ai patogeni (ad esempio, l'upregulation delle citochine), l'RNAseq di massa non ci consente di determinare perché cellule specifiche in una popolazione sono più inclini all'infezione rispetto ad altre. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) è diventato un potente strumento per svelare i programmi trascrizionali specifici del lignaggio cellulare e può essere utilizzato per determinare come questi programmi supportano o reprimono l'infezione virale18,19. La prima descrizione di scRNAseq risale al 2009 ed è stata utilizzata per valutare i profili di trascrizione delle diverse cellule trovate in un blastomero di topo20. Queste tecnologie sono state ora ampliate e possono essere implementate attraverso diverse piattaforme. Le prime versioni di questa tecnologia applicavano il selezionatore di cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) per separare le singole cellule per il sequenziamento, che era spesso limitato a piastre a 96 o 384 pozzetti, dando così 300 singole cellule da analizzare per campione21. Questi metodi sono stati ora avanzati dalle piattaforme di sequenziamento a singola cellula, che utilizzano un dispositivo microfluidico per incapsulare singole cellule in singole goccioline con codice a barre contenente perline. Questa tecnologia consente di acquisire fino a 10.000 celle per condizione del campione.
La combinazione della tecnologia degli organoidi con scRNAseq ci consente di studiare come i patogeni enterici influenzano il tratto gastrointestinale in modo specifico per tipo di cellula. Tuttavia, è necessario prendere diverse considerazioni tecniche e di biosicurezza. Innanzitutto, i metodi classici di coltura degli organoidi (organoidi tridimensionali (3D), incorporati in una matrice extracellulare (ECM)) espongono il lato basolaterale delle cellule epiteliali all'esterno dell'organoide. Poiché i patogeni enterici iniziano la loro infezione attraverso l'ingestione di cibo / acqua contaminati, l'infezione inizia più spesso dal lato apicale delle cellule, che non è accessibile in questi organoidi intestinali 3D. Pertanto, gli organoidi devono essere preparati per rendere il lato apicale accessibile all'infezione da agenti patogeni attraverso la semina 2D, esponendo così direttamente il lato apicale delle cellule, o attraverso la microiniezione22,23. In secondo luogo, per eseguire scRNAseq di campioni biologici infetti, è importante considerare la loro natura infettiva. Mentre sono stati proposti metodi per fissare le cellule e inattivare i patogeni prima dell'isolamento unicellulare per il successivo RNAseq, questi metodi spesso portano ad una diminuzione della qualità del sequenziamento18. Il protocollo seguente descriverà diversi approcci per infettare gli organoidi intestinali con virus enterici considerando il lato dell'infezione (infezione apicale vs basolaterale) (Figura 1). Inoltre, il protocollo includerà un flusso di lavoro per dissociare e isolare singole cellule da organoidi infettati da virus ad alta patogenicità per scRNAseq. Il protocollo evidenzierà i passaggi chiave che devono essere implementati quando si lavora in condizioni di contenimento di livello di biosicurezza 3 (BSL-3) per evitare la generazione di aerosol e la potenziale contaminazione.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Testa di topo ricombinante</td><td>Peprotech</td><td>Cat#250-38</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G9145</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#25300054</td><td></td></tr><tr><td>Piastra trattata con coltura non cellulare a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>Cat#3738</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per camera inferiore in vetro a 8 pozzetti</td><td>iBIDI</td><td>Cart#80827</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>Cat#2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 12634010</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fischer Scientific Cat</td><td>#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di cromo & Successivo GEM Accessory Kit</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000202</td><td>Utilizzato nella preparazione di una soluzione di singola cellula e nella preparazione di Gel beads-in-emulsion (GEM)</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td><td>10X Genomics</td><td>Cat #1000127</td><td>Utilizzato nella preparazione di una soluzione di singola cellula e nella preparazione di Gel beads-in-emulsion (GEM)</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3&prime; Kit v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000268</td><td>Utilizzato nella preparazione di una soluzione a singola cellula e nella preparazione di perle di gel in emulsione (GEM)</td></tr><tr><td>Collagene da placenta umana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat#C5533-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CYP34A forward</td><td>Eurofins</td><td>GATGGCTCTCATCCCAGACTT</td><td>Primer utilizzati per verificare la differenziazione</td></tr><tr><td>CYP3A4 reverse</td><td>Eurofins</td><td>AGTCCATGTGAATGGGTTCC</td><td>Primer utilizzati per verificare la differenziazione</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#11320074</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Car#E9884</td><td></td></tr><tr><td>Fast Read 102 vetrini di conteggio</td><td>Biosigma</td><td>Cat# BVS100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovein Serum (FBS)</td><td>Capricorn</td><td>Cat#FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat3 15630080</td><td></td></tr><tr><td>celle L-WRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td>Questa linea cellulare viene utilizzata per produrre i mezzi condizionati contenenti Wnt 3A, R-spondina e Noggina. Il protocollo per la produzione dei mezzi condizionati è disponibile sul sito dei produttori.</td></tr><tr><td>MatriGel. GFR, LDEV free</td><td>Corning</td><td>Cat#354230</td><td></td></tr><tr><td>MUC-2 forward</td><td>Eurofins</td><td>TGTAGGCATCGCTCTTCTCA</td><td>Primer utilizzati per controllare la differenziazione</td></tr><tr><td>MUC-2</td><td>reverse Eurofins</td><td>GACACCATCTACCTCACCCG</td><td>Primer utilizzati per controllare la differenziazione</td></tr><tr><td>N-acetil-cisteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>OLMF4 forward</td><td>Eurofins</td><td>ACCTTTCCCGTGGACAGAGT</td><td>Primer utilizzati per verificare la differenziazione</td></tr><tr><td>OLMF4 reverse</td><td>Eurofins</td><td>TGGACATATTCCCTCACTTTGGA</td><td>Primer utilizzati per verificare la differenziazione</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human FGF basic</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IGF-1</td><td>BioLegend</td><td>Cat#590904</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante EGF</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>SI forward</td><td>Eurofins</td><td>AATCCTTTTGGCATCCAGATT</td><td>Primer utilizzati per verificare la differenziazione</td></tr><tr><td>SI reverse</td><td>Eurofins</td><td>GCAGCCAAGAATCCCAAT</td><td>Primer utilizzati per verificare la differenziazione</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Caymann Chemicals Gatto</td><td># 10005583</td><td></td></tr></tbody></table>

adattamento degli organoidi gastrointestinali per l'infezione da agenti patogeni e il sequenziamento di singole cellule in condizioni di livello di biosicurezza 3 (bsl-3)

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

Gli organoidi intestinali umani costituiscono il miglior modello cellulare per studiare le infezioni patogene del tratto gastrointestinale. Questi organoidi possono essere derivati da tutte le sezioni del tratto gastrointestinale (gastrico, digiuno, duodeno, ileo, colon, retto) e, al momento della differenziazione, contengono la maggior parte dei tipi di cellule che si trovano naturalmente in ogni singola sezione. Ad esempio, gli organoidi intestinali contengono enterociti che assorbono i nutrienti, cellule secretorie (calice, Paneth e enteroendocrino), cellule staminali e tutti gli intermedi di differenziazione specifici del lignaggio (ad esempio, tipi di cellule precoci o immature). Il più grande vantaggio nell'utilizzo di organoidi derivati dal tratto gastrointestinale per studiare le malattie infettive è la possibilità di identificare con precisione quale tipo di cellula è bersaglio del patogeno enterico e di affrontare se le diverse sezioni del tratto gastrointestinale e i loro specifici tipi di cellule rispondono in modo simile alle sfide dei patogeni. Negli ultimi anni, modelli gastrointestinali, così come organoidi di altri tessuti, sono stati impiegati per studiare il tropismo virale e i meccanismi di patogenesi. Tuttavia, l'utilizzo di tutti i vantaggi dell'utilizzo di organoidi quando si impiegano virus ad alta patogenicità rappresenta una sfida tecnica e richiede rigorose considerazioni di biosicurezza. Inoltre, poiché gli organoidi sono spesso coltivati in tre dimensioni, il lato basolaterale delle cellule è rivolto verso l'esterno dell'organoide mentre il loro lato apicale è rivolto verso l'interno (lume) degli organoidi. Questa organizzazione rappresenta una sfida per i patogeni enterici poiché molte infezioni enteriche iniziano dal lato apicale / luminale delle cellule dopo l'ingestione. Il seguente manoscritto fornirà un protocollo completo per preparare gli organoidi intestinali umani per l'infezione da patogeni enterici considerando il lato dell'infezione (apicale vs basolaterale) per eseguire il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per caratterizzare le interazioni ospite / patogeno specifiche del tipo cellulare. Questo metodo descrive in dettaglio la preparazione degli organoidi e le considerazioni necessarie per eseguire questo lavoro in condizioni di contenimento del livello di biosicurezza 3 (BSL-3).

Preparazione di organoidi per il sequenziamento monocellulare I risultati del sequenziamento a singola cellula dipendono fortemente dall'utilizzo di cellule di buona qualità. Per garantire che gli organoidi siano di buona qualità, dovrebbero essere adeguatamente mantenuti e osservati quotidianamente per determinare quando sono pronti per essere suddivisi (Figura 2). La tempistica della scissione degli organoidi dipende dal donatore; alcuni donatori crescono più rapidamente e devono essere divisi ogni 5 giorni, mentre altri sono più lenti e devono essere divisi ogni 10 giorni. In media, gli organoidi vengono divisi una volta alla settimana quando i centri diventano scuri (Figura 2B). Se gli organoidi sono lasciati diventare troppo grandi e accumulare troppe cellule morte al centro, l'organoide morirà.
Gli organoidi sono mantenuti in un mezzo che contiene elevate quantità di Wnt3A. Questo supporta la nicchia delle cellule staminali e promuove gli organoidi a continuare a crescere e proliferare. In queste condizioni di crescita, gli organoidi contengono elevate quantità di cellule staminali e cellule che amplificano il transito e una minore quantità di popolazioni cellulari differenziate come enterociti maturi, cellule a calice e cellule enteroendocrine. Tuttavia, per imitare la complessità cellulare che si trova all'interno dell'intestino umano, è importante spingere la differenziazione cellulare e produrre più di queste cellule. Ciò si ottiene modificando le condizioni del supporto e rimuovendo Wnt3A e riducendo R-Spondin e Noggin (Tabella 1). Normalmente, la differenziazione cellulare verso enterociti, cellule caliciformi e cellule enteroendocrine richiede 4 giorni di mezzi di differenziazione (Figura 3). È fondamentale ottenere una buona differenziazione; altrimenti, la valutazione del tropismo patogeno e delle risposte specifiche del tipo cellulare diventerà difficile.
Conferma dell'inattivazione del patogeno BSL-3 La piena inattivazione deve essere confermata con l'agente patogeno di scelta e convalidata che è sicuro rimuovere il cDNA dal BSL-3. Per SARS-CoV-2, la completa inattivazione del virus è stata convalidata prendendo 100 μL di SARS-CoV-2 e incubandolo in una macchina PCR per 5 minuti a 85 °C. Il virus è stato quindi aggiunto di nuovo alle cellule vero naïve e l'infezione virale è stata confrontata con il virus non trattato termicamente mediante test di immunofluorescenza e placca a 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo l'infezione per garantire che tutte le particelle non fossero più infettive. Questi risultati sono stati inviati all'agenzia di regolamentazione locale e, dopo la loro approvazione, è stato eseguito l'esperimento a cella singola e l'elaborazione del cDNA.
Risultati del sequenziamento a singola cellula Per valutare come SARS-CoV-2 infetta il colon umano e gli organoidi dell'ileo, è stato eseguito il sequenziamento a singola cellula. Gli organoidi sono stati preparati come descritto sopra e infettati in un formato 2D per consentire l'infezione apicale da SARS-CoV-2. Le cellule infette sono state raccolte a 12 ore e 24 ore dopo l'infezione e sono state elaborate per il sequenziamento a singola cellula come descritto sopra. L'analisi dei dati di sequenziamento a singola cellula ha permesso di determinare che solo una sottopopolazione (enterocita 2 immaturo) di cellule epiteliali intestinali umane supportava l'infezione da SARS-CoV-2 (Figura 4). Inoltre, poiché non tutte le cellule di una popolazione sono state infettate, sono state analizzate sia le cellule infette che le cellule astanti non infette (Figura 5). Questi risultati hanno mostrato che SARS-CoV-2 ha indotto una cascata di segnali pro-infiammatori nelle cellule infette mentre le cellule astanti non infette hanno mostrato una risposta immunitaria mediata dall'interferone. Inoltre, scRNA-Seq ha mostrato che le cellule infette non erano in grado di rilevare gli interferoni a causa del blocco mediato dal virus della via (Figura 5). Non è stato possibile ottenere queste informazioni quando si utilizza il sequenziamento dell'RNA di massa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig01.jpg"> Figura 1: Schema che illustra i tre diversi metodi per preparare gli organoidi intestinali umani all'infezione da patogeni enterici. L'infezione apicale può essere ottenuta attraverso la semina di organoidi intestinali in 2D. Un'infezione apicale e basolaterale può essere eseguita interrompendo l'organoide 3D. Infine, un'infezione solo basolaterale può essere eseguita infettando organoidi intestinali 3D intatti. Ognuno di questi metodi può essere utilizzato per generare campioni per il sequenziamento di singole cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig02.jpg"> Figura 2: Schema di mantenimento degli organoidi e immagini rappresentative dei campi luminosi. (A) Schema per il mantenimento e il passaggio di organoidi intestinali umani. (B). Immagini rappresentative in campo luminoso dei giorni 1, 3, 5 e 7 post-scissione. Entro il giorno 7 gli organoidi diventano grandi e scuri a causa dell'accumulo di cellule morte e sono pronti per essere divisi. La barra della scala indica 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig03.jpg"> Figura 3: QPCR rappresentativa degli organoidi intestinali umani 4 giorni dopo il passaggio ai mezzi di differenziazione. Gli organoidi intestinali sono stati mantenuti nei mezzi di crescita o sono passati ai mezzi di differenziazione per 4 giorni. L'RNA è stato raccolto e la qPCR è stata eseguita per i marcatori di cellule staminali (OLFM4), cellule paneth (LYZ), cellule caliciformi (MUC2) e enterociti (SI). N = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig04.jpg"> Figura 4: Identificazione della popolazione cellulare infettata da SARS-CoV-2. Gli organoidi derivati dal colon umano e dall'ileo sono stati infettati da SARS-CoV-2. Dopo 12 e 24 ore le cellule post-infezione sono state raccolte e sottoposte al sequenziamento dell'RNA unicellulare per identificare quali popolazioni cellulari supportavano l'infezione da SARS-CoV-2. È stato riscontrato che l'infezione da virus aumenta nel tempo e infetta principalmente l'enterocita immaturo 2. Questa cifra è stata modificata da Triana et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig05.jpg"> Figura 5: Determinazione della risposta immunitaria intrinseca innata. Gli organoidi derivati dal colon umano sono stati infettati da SARS-CoV-2. Dopo 12 e 24 ore le cellule post-infezione sono state raccolte e sottoposte al sequenziamento dell'RNA a singola cellula per determinare la risposta immunitaria innata intrinseca sia nelle cellule astanti viralmente infette che in quelle non infette. Le cellule infette da SARS-CoV-2 hanno mostrato una forte risposta pro-infiammatoria mentre le cellule astanti non infette hanno mostrato una risposta mediata dall'interferone. Figura modificata da Triana et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Mezzi di crescita</td>
		</tr>
<tr>
<td>Composto</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Annuncio DMEM/F12</td>
			<td>GlutaMAX (1X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+GlutaMAX</td>
			<td>HEPES 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>+HEPES</td>
			<td>Penna 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>Streptococco 10 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-WRN</td>
			<td>50% in volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 ·</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetil-cisteina</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>FEG</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGF-1 ·</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF di base</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrina</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mezzi di differenziazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>Composto</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Annuncio DMEM/F12</td>
			<td>GlutaMAX (1x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+GlutaMAX</td>
			<td>HEPES 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>+HEPES</td>
			<td>Penna 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>Streptococco 10 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 ·</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetil-cisteina</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-spondin</td>
			<td>5% in volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zucca</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>FEG</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gastrina</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Composizione dei media per i mezzi di crescita e differenziazione.

Questo protocollo descrive come infettare gli organoidi intestinali umani dal loro lato apicale o basolaterale per caratterizzare le interazioni ospite/patogeno a livello di singola cellula utilizzando la tecnologia di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq).

Adattamento degli organoidi gastrointestinali per l'infezione da agenti patogeni e il sequenziamento di singole cellule in condizioni di livello di biosicurezza 3 (BSL-3)

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

Questo protocollo ci permette di capire come i singoli tipi di cellule presenti nell'epitelio intestinale umano rispondono all'infezione virale. Qui presentiamo tre modi indipendenti per seminare organoidi intestinali umani per affrontare il modo in cui la via di infezione può influire sul modo in cui la cellula risponde. Evidenziamo come preparare campioni per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula considerando le normative sulla biosicurezza che devono essere rispettate quando si lavora con agenti patogeni di categoria 3.Questo metodo può essere facilmente adattato ad altri agenti patogeni e colture organoidi. La considerazione più importante è assicurarsi che i modelli di organoidi siano completamente differenziati con il metodo di semina scelto e possano supportare l'infezione virale. Prima di raccogliere gli organoidi infetti, rimuovere le perle di gel unicellulare da meno 80 gradi Celsius e riscaldarle a temperatura ambiente.Inoltre, equilibrare il reagente RT, l'agente riducente B e l'enzima RT C a temperatura ambiente e risospessire l'oligo interruttore modello come descritto nelle istruzioni del produttore. Successivamente, per raccogliere organoidi 3D infetti dal patogeno BSL-3, rimuovere la piastra di coltura cellulare dall'incubatore e posizionarla nella cappa di coltura cellulare. Quindi, utilizzando una pipetta P1000, rimuovere il mezzo di differenziazione da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti, aggiungere 500 microlitri di PBS ghiacciato a ciascun pozzo e incubare a temperatura ambiente per tre minuti.Successivamente, per interrompere completamente la soluzione della matrice extracellulare, pipettare su e giù 10 volte per risospese il PBS, la matrice extracellulare e gli organoidi, quindi trasferire gli organoidi risospesi in un tubo conico da 15 millilitri e posizionare i tubi sul ghiaccio. Raccogliere ogni condizione di infezione in tubi conici separati da 15 millilitri. Dopo aver cambiato i guanti, pulire l'esterno del tubo e rimuovere il tubo dal cappuccio di coltura cellulare.Girare i campioni per cinque minuti. Spostare nuovamente il tubo nella cappa di coltura cellulare e rimuovere il PBS, evitando la risospensione del pellet dell'organoide dal fondo del tubo. Quindi, risospesare il pellet in un millilitro di enzima di dissociazione.quindi cambiare i guanti, pulire il tubo e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante l'incubazione, spostare nuovamente il tubo nella cappa di coltura cellulare ogni 10 minuti e risospesciare gli organoidi tubando su e giù. Per determinare se gli organoidi sono dissociati in singole celle, posizionare 10 microlitri della sospensione organoide in un vetrino monouso in plastica utilizzando una pipetta P10, quindi sigillare la porta di ingresso del campione con nastro trasparente.Dopo aver cambiato i guanti, pulire l'esterno del contatore cellulare e utilizzando un microscopio Brightfield, confermare che sia stata creata una sospensione a singola cellula. Dopo la conferma della sospensione a cella singola, interrompere la digestione aggiungendo un millilitro di supporto DMEM F12 contenente il 10% di FBS e pipetta su e giù 10 volte. Quindi cambiare i guanti, pulire il tubo e far girare il campione.Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il mezzo contenente l'enzima di dissociazione, avendo cura di non disturbare il pellet cellulare sul fondo. Quindi risospesciare le singole celle in un volume minimo di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Dopo aver passato la sospensione cellulare in un tubo FACS attraverso un filtro per rimuovere grandi grumi, posizionare il tubo su ghiaccio.Successivamente, per determinare il numero di cellule per microlitro, aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare a una camera di conteggio delle celle in plastica usa e getta. Quindi sigillare la porta di ingresso del campione con nastro trasparente prima di rimuovere il campione dalla cappa di coltura cellulare. Cambiare i guanti, pulire la camera di conteggio delle cellule, quindi contare il numero di cellule utilizzando un microscopio Brightfield.Successivamente, all'interno della cappa di coltura cellulare, preparare un mix principale di reagente RT, oligo di commutazione modello, agente riducente B ed enzima RT C in un tubo da 1,5 millilitri secondo le istruzioni del produttore a seconda del numero di campioni nell'esperimento. Per ogni campione, aliquota 33,4 microlitri di master mix in un tubo PCR, quindi aggiungere le cellule e l'acqua alla miscela master in base al numero di cella target. Dopo aver cambiato i guanti, spostare il controller a cella singola nel cappuccio di coltura cellulare e preparare il chip.Quindi, aggiungere il chip a cella singola nel supporto del chip e riempire le corsie inutilizzate con il 50% di glicerolo. Aggiungere il mix principale, le perline e l'olio di partizionamento alle corsie contenenti campioni secondo le istruzioni del produttore e coprire il chip con una guarnizione. Dopo aver caricato il chip nel controller, avviare il programma.Al termine del programma, rimuovere il chip e la guarnizione, quindi utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri delle emulsioni per pulire i tubi PCR. Assicurarsi che ogni emulsione abbia un colore bianco uniforme che indichi che si è verificata un'emulsione completa. Dopo aver cambiato i guanti e pulito i tubi, trasferire i tubi PCR su una macchina PCR e avviare il programma.Alla fine dell'esecuzione della PCR, la maggior parte dei virus avvolti verrà inattivata. Le immagini rappresentative di Brightfield ai giorni uno, tre, cinque e sette organoidi post-scissione sono mostrate qui. In media, gli organoidi vengono divisi una volta alla settimana quando i centri diventano scuri.Modificando le condizioni dei media, rimuovendo Wnt-3a e riducendo R-spondin e noggin, la complessità cellulare trovata all'interno dell'intestino umano può essere imitata. Normalmente, la differenziazione cellulare verso le cellule paneth, le cellule caliciformi e gli enterociti richiede quattro giorni di mezzi di differenziazione. L'analisi dei dati di sequenziamento a singola cellula del colon umano infetto da SARS-CoV-2 e degli organoidi derivati dall'ileo ha mostrato che solo una sottopopolazione di cellule epiteliali intestinali umane supportava l'infezione da SARS-CoV-2 dopo 12 e 24 ore.L'analisi delle risposte immunitarie innate negli organoidi derivati dal colon infetti da SARS-CoV-2 ha mostrato che SARS-CoV-2 ha indotto una cascata di segnali pro-infiammatori nelle cellule infette mentre le cellule astanti non infette hanno mostrato una risposta immunitaria mediata dall'interferone. Inoltre, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha mostrato che le cellule infette non erano in grado di rilevare gli interferoni a causa del blocco mediato dal virus del percorso. Gli organoidi devono essere ben differenziati e sani.Questo può essere controllato determinando il livello dei marcatori di differenziazione cellulare mediante qPCR prima dell'infezione. Se le cellule non sono ben differenziate, non supporteranno l'infezione virale e porteranno a risultati non informativi. Questa tecnica ci consente di infettare la mucosa sia dal lato luminale che da quello tissutale.Questo è molto importante in quanto ci consente di svelare i meccanismi utilizzati dalle superfici della mucosa per tollerare un ambiente sporco da un lato e uno sterile dall'altro.

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Le colture derivate da cellule staminali hanno un enorme potenziale per modellare le malattie infettive. Qui viene descritta la coltura di organoidi gastrici di topo e umani derivati da cellule staminali adulte. Gli organoidi vengono microiniettati con l'agente patogeno gastrico Helicobacter pylori.

Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell&#39;uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell&#39;Helicobacter Pylori

Gli organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) offrono interessanti opportunità per modellare le malattie enteriche in vitro. Dimostreremo la differenziazione degli hiPSCs in organoidi intestinali (iHOs), la stimolazione di questi iHOs con citochinesi e la microiniezione di Salmonella typhimurium nel lume Iho, permettendo lo studio di un'invasione epiteliale da parte di questo agente m patogeno.

Utilizzando organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotta dall'uomo per studiare e modificare la protezione delle cellule epiteliali contro la Salmonella e altri patogeni

Qui descriviamo una tecnica per quantificare l'integrità della barriera di piccoli organoidi intestinali. Il fatto che il metodo si basi su organoidi viventi consente l'indagine sequenziale di diverse sostanze o combinazioni di integrità della barriera in modo risolto nel tempo.

Indagare la rottura della barriera intestinale negli organiidi viventi

Qui presentiamo due protocolli che consentono la modellazione di interazioni intestinali apicali-specifiche. I monostrati intestinali di derivazione organoide e le colture Air-Liquid Interface (ALI) facilitano la generazione di epitelia ben differenziate accessibili sia dal lato luminare che basolaterale, mentre gli organoidi intestinali invertiti dalla polarità espongono il loro lato apicale e sono suscettibili a test ad alta produttività.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

Questo studio presenta un protocollo per la generazione di monostrati 2D intestinali bovini da organoidi, offrendo un migliore accesso per lo studio delle interazioni ospite-patogeno. Include metodi per valutare l'integrità e la funzionalità della membrana, avanzando modelli in vitro che imitano la fisiologia gastrointestinale del bestiame. Questo approccio promette significativi benefici biomedici e agricoli, tra cui strategie di trattamento avanzate.

Progressi nella tecnologia degli organoidi bovini utilizzando interfacce monostrato per l'intestino tenue e crasso

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi intestinali apicali da colture di organoidi standard incorporate in matrice. Delinea inoltre la successiva incorporazione di EdU in cellule che proliferano attivamente e la quantificazione semiautomatica di cellule EdU-positive.

Generazione di organoidi apicali intestinali e valutazione del tasso di proliferazione degli organoidi mediante marcatura EdU

Lo studio presenta un metodo per l'indagine in vitro delle infezioni batteriche utilizzando organoidi intestinali derivati dalle cellule staminali tissutali. Il protocollo descrive come coltivare e differenziare gli organoidi in due dimensioni, infettarli con Escherichia coli invasiva da aderenti e valutare i dati chiave, tra cui la rottura della barriera epiteliale, l'imaging infezionale e la risposta dell'RNA epiteliale.

Una coltura organoide bidimensionale su estratto di invasina o membrana basale per studiare le interazioni ospite-batteri

Scopri come infettare organoidi intestinali umani per studiare le interazioni ospite-patogeno a livello di singola cellula con sequenziamento scRNA-seq. Questo metodo BSL-3 rivela risposte immunitarie specifiche.

Adattamento degli organoidi gastrointestinali per linfezione da agenti patogeni e il sequenziamento di singole cellule in condizioni di livello di biosicurezza 3 (BSL-3) (Video) | JoVE Journal

Adattamento degli organoidi gastrointestinali per l'infezione da agenti patogeni e il sequenziamento di singole cellule in condizioni di livello di biosicurezza 3 (BSL-3)

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